TECNICAS DE BIOLOGIA MOLECULAR Química Biológica Patológica TECNICAS DE BIOLOGIA MOLECULAR II- Parte Aplicadas al diagnóstico de Enfermedades Genéticas 2017  Dra. Silvia Varas svaras@unsl.edu.ar Tema:1 (b)

GENERALIDADES

Nomenclatura Hebras de ADN ! Cadena Codificante, Informativa, sens o cadena (+) Secuencia publicada en Gene Bank! 5’ 3’ 3’ 5’ Cadena Molde, no-codificante, no-informativa, antisentido (anti sens) o cadena (-)

TIPOS de SECUENCIAS en el ADN GENOMICO Altamente repetitiva: VNTR, STR Medianamente repetitiva: Secuencias Alu, trasposones (LTR), RNAr, histonas, telomeros. DNA copia única Genes estructura exon-intron. SC Altamente Repetitivo Medianamente Repetitivo Copia Unica DC

Enzimas de Restricción Cuando una bacteria es invadida por un organismo que contiene ADN, por ej por un virus, se puede defender con las enzimas de restricción (ER), denominadas también como endonucleasas. ER reconocen una corta secuencia de ADN en forma especifica y corta ambas hebras. La secuencia de reconocimiento es un palíndrome. ER son bautizadas con el nombre de la bacteria donde se aisló, mas un número de secuencia (por ej. Eco RI).

Denominación ER: ej: EcoRI Endonucleasa de Restricción 5’….GAATTC.….3’ ….CTTAAG…. Denominación ER: ej: EcoRI la 1º enzima hallada Escherichia coli Genero Especie R13 Cepa 6

La Frecuencia de la presencia de la secuencia hexamérica: 5’….GAATTC.….3’ ….CTTAAG…. La Frecuencia de la presencia de la secuencia hexamérica: 1/4096 (4-6) Al azar 7

Digestión del ADN con endonucleasa EcoRI (Fragmento mayor) (Fragmento más pequeño) Considerar una molécula de ADN linear con 6 copias de GAATTC: habrá 7 fragmentos los cuales se podrán separar por tamaño en un gel de electroforesis. 8 Digestión del ADN con endonucleasa EcoRI

Las diferentes enzimas reconocen y cortan el ADN genómico en distintas frecuencias EcoRI reconoce la secuencia hexamérica: 4-6 Sau3A1 reconoce la secuencia tetramérica: 4-4 9

Enzimas Restricción Sub-unidades Catalíticas Sub-unidades Reconocimiento

Ejemplo: (Eco RI) (corta) 5’ – GAATTC – 3’ 3’ – CTTAAG – 5’

Los enzimas de restricción son proteínas homodímericas y reconocen secuencias de DNA palindrómicas BamHI G ' GATCC SITIO INESPECÍFICO SITIO ESPECÍFICO

TIPOS DE CORTE PRODUCIDOS POR E. RESTRICCIÓN Extremos cohesivos 3’ Extremos romos Extremos cohesivos 5’

Condiciones a tener en cuenta en la hibridización:

Definiciones Una probe o sonda es un secuencia de oligonucleótidos simple hebra y esta marcado con radio isótopo (32P) o fluorescente. Su secuencia es complementaria a la secuencia de interés, cuya secuencia es conocida. Hibridización: unión por apareamiento de bases de dos moléculas de acido nucleico. Tm: Temperature melting= temperatura a la cual las hebras de un duplex están disociadas en un 50%.

DESNATURALIZACIÓN DEL DNA 1. Composición de bases 2. Longitud DNA doble 3. Fuerza iónica

Factores que afectan la velocidad de hibridización Longitud del acido nucleico. Composición de base. Fuerza iónica. Viscosidad. Temperatura Agentes desnaturalizantes. pH

Longitud del acido nucleico. Composición de base. K  longitud Composición de base.  % CG aumenta la re-asociación Fuerza ionica.  Na+ aumenta la re-asociación Viscosidad Moléculas pequeñas (glicerol, sacarosa): disminuye la velocidad de re-asociación. Polímeros de alto PM (PVP, Dextran, Ficoll): aumenta la velocidad de re-asociación.

Agentes desnaturalizantes. Temperatura A  Temp  se rompen las uniones puentes de Hidrogeno. Se define como la t° óptima de hibridización a aquella donde la velocidad de hibridización es máxima. Y es gralmente 25ºC por debajo de la T° de melting. Agentes desnaturalizantes. Formamida: Baja la T° óptima de hibridización de 0,72°C cada 1% pH A una [NaCl] de 0,4M la velocidad de hibridizaciónes independiente del pH (en un rango de 5-9).

Polimorfismo genético LOCUS POLIMORFICO: es una variante muy común que se encuentra en más del 1% de los cromosomas de la población en general. MUTACION

Sin embargo, los términos "mutación" y "polimorfismo", a menudo conducen a confusión debido a suposiciones incorrectas acerca de los efectos patógenos de la “mutación” y benignos del “polimorfismo”. Se propone por lo tanto sustituir ambos términos por el término “variante” con los siguientes términos modificadores: (i) patogénica, (ii) probablemente patógena, (iii) significado incierto, (iv) probablemente benigna, o (v) benigna.

SNP: Polimorfismos de nucleótido único Los SNP son comunes y ocurren una vez cada 1000 pares bases. Marcarían la susceptibilidad a una enfermedad mas que su causa directa

Los Polimorfismos nucleótido único (SNPs) son secuencias en el genoma que difieren en un solo par de nucleótidos entre una porción de la población y otra. Cuando 2 alelos se comparan y hay solo 1 nt de diferencia se llama SNP, (pronunciado como snips) (single nucleotide polymorphisms). Hay mas de 10 millones de SNP Se han identificado mas de 6 millones de SNP Hay 1 SNP/1000 pb.

Polimorfismo de Restricción RFLP: Restriction Fragment Length Polymorphism

RFLPs Condición: La presencia de una mutación es ligada a un polimorfismo de restricción La mutación y el polimorfismo no deben estar separados a una distancia mayor de 106 nucleótidos para que sean coheredados juntos.

RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphisms) Como se puede detectar un RFLP? a) Por técnicas de Southern Blotting Extracción de ADN Digestion con la Enzima de Restricción apropiada Separación de los fragmentos por electroforesis y transferencia a membrana (Southern Blotting) Hibridización con la Sonda o Probe especifica, revelado. Análisis de los resultados

C B A

PCR: PRINCIPIOS PCR es un sistema no celular de clonado del ADN

Kary Mullis, el inventor de la PCR fue premiado en 1993 con el Premio Nobel en Química

El ciclo de amplificación de PCR Cada ciclo requiere tres pasos de temperaturas para completar un ronda de la síntesis de ADN.

Paso 1: Desnaturalización del DNA Esto ocurre a 92-95 ºC

Paso 2: Annealing o Unión de Primers Reverse Primer Forward Primer Los cebadores se unen a la secuencia complementaria sobre DNA target.

Tm ºC = 2(nº A + T) + 4(nº G + C) Calculo de Tm Tm ºC = 2(nº A + T) + 4(nº G + C) Ejemplo: S- IGFI: AGC CTC GAC AGC CTG CCC CAG G Tm ºC = 2( 4 + 2) + 4( 6 + 10) Tm ºC = 2(6) + 4(16) Tm ºC = 12 + 64= 76 Tm = 76 ºC

Paso 3: Extensión o “Primer Extension” 5’ 3’ extension 3’ 5’ extension 3’ 5’ DNA polimerasa cataliza la extensión de la hebra en sentido 5’3

Amplificación Exponencial Ciclos Copias 1 2 4 16 10 1.024 15 32.768 20 1.048.576 25 33.554.432 30 1.073.741.824

Fases en una reacción de PCR El producto de PCR se acumula en función del número de ciclos. Se distinguen las siguientes fases: La fase exponencial  hasta cerca del ciclo 30 esta bajo las condiciones estándar de reacción. La  fase plateau  resulta de cantidades limitantes de enzima y/o reducción actividad enzimática.

Causas del Efecto Plateau Agotamiento de los sustratos (dNTPs o primers). Estabilidad de los reactivos (dNTPs o enzima) particularmente a la tº de desnaturalización. Inhibición por los productos finales generados (pirofosfato, duplex de DNA).

El tamaño del fragmento producido en PCR depende de los primers Reverse primer Forward primer Tamaño de los fragmentos que son amplificados

Ventajas y Desventajas Rapidez Sensibilidad Fortaleza DESVENTAJA DE PCR COMO METODO DE CLONADO: Se debe conocer la secuencia Producto generalmente pequeño Infidelidad de la replicación del ADN

Típica reacción de PCR: El

Tipos de PCR PCR-RFLP (PCR-ER) ARMS-PCR MAS-PCR PCR- SONDAS ASO (DOT BLOT) GAP-PCR MUTAGENESIS MEDIADA POR PCR