Vamos a elaborar un mapa de restricción de un plásmido bacteriano Dpto. Biología y Geología. Prof. Eduardo Benítez. Cultura Científica 1º Bachillerato. Biotecnología. MAPA DE RESTRICCIÓN Vamos a elaborar un mapa de restricción de un plásmido bacteriano Esta obra está bajo una Licencia Creative Commons Atribución-NoComercial 4.0 Internacional.
1. En primer lugar hemos realizado un procedimiento de extracción de ADN semejante al que estudiamos en la práctica 1 para conseguir aislar únicamente el ADN plasmídico de la bacteria.
2. A continuación hemos utilizado una micropipeta para añadir los enzimas de restricción EcoRI y Sal1 a nuestra muestra de ADN plasmídico.
3. Los enzimas de restricción han cortado el ADN plasmídico en sus puntos de restricción. Observa cómo funcionaría el enzima EcoRI en un plásmido con una sola diana de restricción para este enzima: https://www.khanacademy.org/science/biology/biotech-dna-technology/dna-cloning-tutorial/a/restriction-enzymes-dna-ligase
4. Con los fragmentos obtenidos tras la digestión enzimática hemos llevado a cabo una electroforesis para separarlos.
5. Estos son nuestros resultados:
¿Cuántos fragmentos de ADN se obtienen en la digestión con EcoRI? 6. Responde: ¿Cuántos fragmentos de ADN se obtienen en la digestión con EcoRI? Teniendo en cuenta que el plásmido es circular, ¿cuántos sitios de restricción son necesarios para que al cortar con EcoRI obtengamos ese número de fragmentos? Compara las bandas de la calle 1 con las del marcador. ¿Qué tamaño tendrán los fragmentos que se obtienen al digerir con EcoRI? ___¿?_______ Kilobases EcoRI ___¿?_______ Kilobases
7. Rellena el tamaño de todos los fragmentos de ADN que se obtienen: _¿?__ Kb _¿?__ Kb _¿?__ Kb _¿?__ Kb _¿?__ Kb _¿?__ Kb _¿?__ Kb _¿?__ Kb
8. Responde: Sumando la longitud de los fragmentos ¿Cuál será la longitud total del plásmido? La longitud de cada sector es de 1,5Kb, si ponemos la primera diana de EcoRI en la posición indicada, ¿dónde se situaría la segunda aproximadamente para que obtengamos un fragmento más corto (2,4 kb) y otro más largo (3,6kb)? EcoRI
9. Responde: ¿Cómo sería el mapa de restricción considerando el enzima Sal1 exclusivamente? SalI
10. Responde: Observa las bandas electroforéticas que se obtienen al combinar los dos enzimas de restricción. ¿Cuántas bandas se obtenían al cortar solo con EcoRI? ¿Cuántas bandas se obtienen al utilizar ambos enzimas? ¿Qué efecto tendrá SalI sobre los fragmentos que se obtenían con EcoRI?
11. Estos son los dos fragmentos obtenidos al cortar con EcoRI, teniendo en cuenta los fragmentos que se obtienen al digerir también con SalI indica la posición exacta en que están siendo cortados. Utiliza la regla para situar la flecha adecuadamente e indica los tamaños de todos los fragmentos: SalI SalI _¿?__ Kb _¿?__ Kb _¿?__ Kb _¿?__ Kb _¿?__ Kb _¿?__ Kb
12. Traslada la información del ejercicio anterior al mapa de restricción e indica la posición en que corta cada enzima considerando que la primera diana de ECORI está en la posición 0/6kb. (Este esquema funciona como un reloj). _¿?__Kb SalI SalI _¿?__Kb _¿?__Kb
13. ¿Cuál será la secuencia de bases que encontraremos en los puntos de restricción de ECORI? 14. ¿Y en los puntos de restricción de SalI? https://es.wikipedia.org/wiki/Enzima_de_restricci%C3%B3n