TECNICAS DE BIOLOGIA MOLECULAR Química Biológica Patológica TECNICAS DE BIOLOGIA MOLECULAR Aplicadas al diagnóstico de Enfermedades Genéticas 2017 Tema:1 (d)  Dra. Silvia Varas svaras@unsl.edu.ar

TIPO DE MUTACION DEFINE LA TECNICA DE BIOLOGIA MOLECULAR A USAR PARA EL DIAGNOSTICO MOLECULAR

Espectro de diferentes tipos de mutaciones en genes humanos (Human Gene Mutation Database) 3º 1º 2º  Mutaciones puntuales 67%

Mutaciones Del/Ins Grandes deleciones (8 %) Pequeñas deleciones (15%) Rearreglos Complejos (1%) Grandes Inserciones y Duplicaciones (2%) Pequeñas Indels (1%) Expansión de repeticiones de trinucleótidos (0,3%)

Espectro de diferentes tipos de mutaciones en genes humanos (Human Gene Mutation Database) 2% 8% 6,1% 15% 2% 9 % 56 %

Estrategias en el laboratorio de Biología Molecular Grandes Deleciones Southern Blotting PCR Multiplex GAP-PCR MLPA Mutaciones Puntuales y deleciones pequeñas RFLP-PCR(ER-PCR) Mutagenesis mediada por PCR Alelo-Específicas: MAS-PCR ARMS- MARMS DOT-ASO

Estrategias en el laboratorio de Biología Molecular II Desconozco la mutación o polimorfismo SSCP (single strand conformation polymorphism) DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis)

Estrategias en el laboratorio de Biología Molecular Grandes Deleciones Southern Blotting GAP-PCR PCR Multiplex MLPA

Tipos de Blots Southern Blot – transfiere DNA y la sonda o probe es de ADN Northern Blot – transfiere RNA y la sonda o probe es de ADN Western Blot – transfiere proteínas y la sonda o probe son anticuerpos.

The Southern blotting technique

6: 7: 8 y 9: 10 y 11:

Estrategias en el laboratorio de Biología Molecular Grandes Deleciones Southern Blotting PCR Multiplex GAP-PCR MLPA

PCR Multiplex Es una variante de PCR en donde dos o más loci son simultáneamente amplificados en la misma reacción. Cuidados especiales: 1-Los primers de 18-24 pb deben tener un contenido de GC 35-60% de esa forma tiene una T anneling de 55-58ºC o mayor. 2-Distribuir los amplicones de distintos tamaños. 3-Diseñar primers con características similares: sin estructura secundaria ni interacciones entre ellos. 4-Se debe calcular el Tm (no muy diferentes entre primers) y analizar las interacciones entre los primers).

Cuidados especiales II: PCR Multiplex Cuidados especiales II: 5- Se deberá optimizar: Tº extensión, Tiempo de extensión, Tiempo y temperatura de anneling, número de ciclos, cantidad de primers, concentración de dNTP y MgCl2, uso de adyuvantes (glicerol, DMSO, BSA), etc.

sobre la base de 2 series de oligonucleótidos, el promotor muscular (Pm) y 17 exones que cubren las regiones donde se acumula el mayor número de deleciones de la distrofina (Pm, 3, 4, 6, 8, 12, 13, 17, 19, 43, 44, 45, 47, 48, 50, 51, 52 y 60).

sobre la base de 2 series de oligonucleótidos, el promotor muscular (Pm) y 17 exones que cubren las regiones donde se acumula el mayor número de deleciones de la distrofina (Pm, 3, 4, 6, 8, 12, 13, 17, 19, 43, 44, 45, 47, 48, 50, 51, 52 y 60).

Desde acá

Estrategias en el laboratorio de Biología Molecular Grandes Deleciones Southern Blotting PCR Multiplex GAP-PCR MLPA

GAP-PCR. Se utiliza un par de primers que flanqueen la zona delecionada (para el alelo mutado) y un primers ubicado sobre la deleción (para el alelo normal). Se generará dos productos de amplificación: - Un fragmento proveniente del alelo normal y – otro fragmento del alelo mutado. El tamaño de cada uno dependerá donde hibridizan los primers diseñados.

Delecion African HPFH-2 Deleción Alelo N (P1-P2): Alelo M (P1-P3):

Estrategias en el laboratorio de Biología Molecular Grandes Deleciones Southern Blotting PCR Multiplex GAP-PCR MLPA

MLPA (múltiple amplificación de sondas dependiente de ligación) Es una técnica basadas en una amplificación cuantitativa por PCR. Presentan la ventaja de permitir el análisis de hasta 40-50 secuencias blanco simultáneamente. Son técnicas muy usadas para detección de delecciones y duplicaciones del genoma. Se aplica a estudios en genética humana, citogenética e investigación en cáncer

Instrumentos Un termociclador y un sistema de electroforesis tipo de secuencia son requeridos para MLPA Los resultados son obtenidos en 24 hs. Mas de 96 Ms pueden ser procesados en un experimento

Constitución de cada Sonda (Probe) En la MLPA cada juego de sondas o probes consiste de 2 oligonucleotidos: La sonda oligonucleotido izquierda(LPO) (7) y la sonda oligonucleotido derecha(RPO) (8) Cada oligo a su vez contiene 3 partes: La secuencia hibridización (azul) La secuencia espaciadora, opcional (verde) La secuencia donde annealing los primers FyR (negro)

Las sondas hibridizan de manera inmediatamente adyacente, de esta manera solo aquellos pares de sondas que encuentran sus secuencias blanco pueden ser ligadas y amplificadas por PCR.

MLPA: Protocolo de ensayo. Las sondas que reconocieron su secuencia blanco y pudieron ser ligadas son amplificadas por PCR, usando un único par de primers. Todos los amplicones generados deben tener diferente tamaño. Los productos obtenidos son separados por electroforesis capilar y detectados debido a su marcación fluorescente (usualmente en uno de los primers)

Protocolo típico de MLPA

MLPA: Resultados Las secuencias donde hibridizan primers F yR son = El tamaño de la secuencia blanco es = El tamaño del brazo espaciador es ≠

VENTAJAS de MLPA: PROBLEMAS de MLPA: Detección de número de copias de 40-50 secuencias de ADN genómicos en una simple reacción, basada en PCR Requiere únicamente 20 ng de ADN humano (3.000 células/0,5 ml de fluido amniótico). MLPA puede ser usado sobre Ms de ADN parcialmente degradadas tales como ADN extraído de tacos de tejidos parafinados. PROBLEMAS de MLPA: Necesidad de instrumental especifico Costo

Ejemplo

Deleciones

Estrategias en el laboratorio de Biología Molecular II Desconozco la mutación o polimorfismo SSCP (single strand conformation polymorphism) DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis)

SSCP (Polimorfismos de conformación de cadena única) SSCP (single strand conformation polymorphism) es un método simple y accesible para detectar alteraciones en la secuencia en un fragmento obtenido por PCR

SSCP (Polimorfismos de conformación de cadena única) La técnica de SSCP detecta variaciones en la secuencia del ADN (mutaciones puntuales y otros pequeños cambios) debido a la generación de diferencias en la movilidad electroforética. Bajo condiciones no desnaturalizantes, las moléculas de ssADN asumen conformaciones únicas que dependen de su secuencia de nucleótidos. Los cambios conformacionales producidos por variaciones en la secuencia de ADN pueden resultar en diferencia detectables por la movilidad en un gel.

Amplificación zona interés. La muestra se enriquece en ssADN por medio de una PCR asimétrica, debido a la presencia de uno de los primers en mayor cantidad que el otro. Desnaturalización del producto PCR con (formamida)+ 100ºC- 5’. Las movilidades de los fragmentos simple cadena se comparan mediante electroforesis en un gel neutro de poliacrilamida. Las bandas son detectadas con tinción con plata. PCR 2ul PPCR+ 10 ul formamida Rápido enfriamiento

SSCP Gel poliacrilamida 6% Después de la tinción, el gel se puede dividir en dos partes: la parte con las bandas correspondientes a los alelos de simple cadena (SS) y la otra parte con las bandas de doble cadena (DS) donde se pueden distinguir pequeñas deleciones o inserciones. El carril 1 corresponde al patrón WT para cualquier locus dado analizado. 2- Control homocigota para la mutación a 3- Corresponde a un caso heterocigota para mutación a. 4-Heterocigota pequeña deleción. 5- Homocigota para una pequeña deleción. 6- Heterocigota para una pequeña inserción. Inserción Deleción  Mutación aa  Mutación Aa  AA 

DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis) simple complejo Los productos de PCR son cargados en un gel con un gradiente desnaturalizante Típicamente 20-80% formamida ADN doble cadena migra hasta encontrar su melting El melting es determinado por su secuencia y contenido de GC Las diferentes secuencias migran a diferentes distancias 20% 80%

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