PARASITOLOGÍA DIAGNÓSTICA Diplomado PARASITOLOGÍA DIAGNÓSTICA Asociación de QFB y TLC del Laboratorio Clínico del Hospital Civil de Guadalajara A.C.

RECOLECCIÓN, Transporte Y CONSERVACIÓN DE LA MUESTRA DE HECES Dra. Gabriela G. Carrillo Núñez Noviembre 11, 2017

Estudio de laboratorio, NOM-007-SSA3-2011 Para La Organización y Funcionamiento de los Laboratorios Clínicos Laboratorio clínico, al establecimiento público, social o privado, legalmente establecido, independiente o ligado a otro establecimiento para la atención medica de pacientes hospitalarios o ambulatorios, que tenga como finalidad realizar estudios de laboratorio, cuyos resultados coadyuvan en el estudio, prevención, diagnostico, resolución y tratamiento de los problemas de salud. Estudio de laboratorio, La medición y resultados del análisis físico, químico o biológico de componentes y productos del cuerpo humano, a través de tiras reactivas o tecnologías similares, que sean ofertados al publico en general, y realizado por personal facultado para ello, en un laboratorio clínico legalmente establecido.

La importancia de las heces fecales Proporcionan información valiosa Orientan en cuanto a enfermedades como: Procesos alérgicos o inflamatorios en lactantes Procesos infecciosos bacterianos, virales o parasitarios Problemas digestivos como mala absorción Pérdida de sangre en diferentes trayectos del tubo digestivo

Examen parasitoscopico Es un conjunto de técnicas diagnósticas que constituyen la indicación metodológica para la identificación de la mayoría de las enteroparasitosis causadas por protozoarios o helmintos. La indicación toma en cuenta cuadro clínico que presenta el paciente, y debe atender al parásito que se sospecha, protozoarios y helmintos. Para obtener resultados satisfactorios, debe cumplir con los siguientes requisitos: 1) Solicitud de Examen coproparasitario. 2) Preparación del paciente. 3) Muestra correctamente obtenida. 4) Muestra seriada (3 muestras mínimas de materia fecal).

coprológico ¿Para qué se utiliza? ¿Qué es? Problemas de Mala digestión Mala absorción Ca de colon Úlceras asintomáticas Examen completo de materia fecal el cuál incluye: Análisis de: las propiedades físicas propiedades químicas Microscopia ¿Qué valora? Presencia de sangre en heces Parásitos huevecillos, quistes Cálculos biliares

coproscópico Valor depende de la rapidez de estudio de la muestra pH, Azúcares reductores, Pastillas Clinitest™ Recuento de leucocitos () Neutrófilos +10XC = bacteriana No segmentados = viral

Qué es un examen Parasitológico: Determinar la presencia de Protozoarios Quistes Trofozoítos Determinar la presencia de Helmintos: Huevecillos Larvas Gusanos adultos Completos Partes Herramienta de gran utilidad en múltiples padecimientos.

Para Qué un examen Parasitológico: Para determinar contenido y peso de las heces. Macroscópicamente observar si hay presencia de pus, sangre, moco, grasas

Examen macroscópico de las heces Consistencia (grado de humedad) Presencia de Sangre Moco Pus

Como recoge un paciente una muestra de heces para estudio… https://youtu.be/YUV9oSbsyas

PROCEDIMIENTOS BÁSICOS recolección heces

Que afecta una muestra de heces Tomar muestras antes de procedimientos radiológicos con sulfato de bario o después de una semana. Medicamentos como: Aceite mineral Bismuto Preparaciones antidiarreicas Antimalaricos Tetraciclinas Laxantes Algunos alimentos pueden teñir las heces y confundir diagnóstico 48- 72 hs. antes de realizarse el estudio, libre de frutas, verduras y grasas Bailey & Scott Diagnostic Microbiology. Ed Mosby. 9th Ed. 1994

¿cuántas muestras es bien? 1, 2, 3… Depende de La calidad del espécimen Exactitud de la manipulación de la muestra Severidad de la infección Rutina Tres es lo adecuado Dos tránsito normal, uno luego de usar un catártico como sulfato de magnesio (sin aceite mineral) Seis muestras 90% positivo Sospecha de amibiasis Alternadas No más de 10 días No más de 14 días Post tratamiento Antiprotozoarios: 3- 4 semanas posteriores Antihelmintos: 1-2 semanas 5-6 sem en Tenias Bailey & Scott Diagnostic Microbiology. Ed Mosby. 9th Ed. 1994

Toma de muestra Recipiente de boca ancha Sin conservador: Defecar directamente en el recipiente si es posible o sobre papel y transferir al recipiente Recipiente de boca ancha Sin conservador: Cultivos PCR Frasco con conservador PVA, si se demora el traslado de la muestra Lavarse las manos antes y después de la manipulación (usar guantes) Bailey & Scott Diagnostic Microbiology. Ed Mosby. 9th Ed. 1994

…Y donde la pongo Desenroscar la tapa del Copro-G con la paleta incorporada Sumergir la cucharilla en el formol Recoger la cantidad de heces que quepan en la cucharilla Agitar para suspender las heces en el líquido

Toma en niños Menores de dos años Mayores de dos años Si usa pañal: Evite que la orina y las heces se mezclen Hisopado rectal y contener la muestra en tubo de ensaye o portaobjetos Uso de bacinica o escusado Evitar contaminación de agua, orina o suciedad Tipo embudo para recolectar

Como utilizar Copan Fecal Swab para hisopados rectales o toma de muestras fecales https://youtu.be/12qzamjeAoA

Córrele… Transportar la muestra en menos de 30 minutos al laboratorio. Muestra aceptable: Tamaño (huevo de paloma, nuez) Muestra líquida 10-15 ml Sin orina (trofozoítos amiba) y limpia Mantenerla en refrigeración o a la sombra

Recuerda etiquetarla Nombre del paciente Edad Número de cuarto o sala Naturaleza de la muestra Hora de toma de la muestra Sitio de donde se obtuvo Diagnóstico clínico Duración de la enfermedad Prueba requerida

Tomar en cuenta Datos clínicos del paciente, Antecedentes Personales, inmunosupresión Familiares, parasitosis de grupo o parasitosis con una fuente de infección común para todos los integrantes Ambientales, vivienda sin agua potable, saneamiento, etc. Viajes al extranjero (zonas endémicas de parasitosis exóticas o de baja prevalencia para nuestro medio) Tienen implicancias en el procesamiento de la muestra.

Sistema para concentración de parásitos fecales Recolección de la muestra: Defecar en un recipiente limpio y seco Evitar contaminación con agua y orina Elegir cantidad adecuada de heces Mantener cerrado la parte inferior del tubo Remitir al laboratorio para procesar. Homogeneizar la muestra 30” Doble filtración y concentración, cambio de tapón inferior por cono de sedimientación Recoger sedimento Easy Pick® Almacenar o desechar Más limpio, manejo de muestra mínima Más pequeño, ahorro de espacio en el laboratorio Más eficaz, doble filtración permite mejor resultado con menos volumen Ecológico, menos reactivos, menos daño al ambiente.

Protocolo de utilización del Minisystem y Midisystem https://youtu.be/iCKtW7VPros

Métodos de conservación

¿Y si no conservo bien la muestra? No sirven para observaciones Puede producirse deformación de formas quistes y huevos Puede producirse destrucción de trofozoítos Puede dar resultados falsos o erróneos

Tipo de heces Método ideal Análisis directo Solución salina Lugol sin preservador Tipo de heces Líquidas/blandas Consistentes/duras

Refrigeración 3-5ºC Preserva trofozoítos por varios días Quistes en heces normales duran hasta un mes viables Evitar la deshidratación de la muestra Utilizar frasco hermético NUNCA congelar

Solución de formol 5% y 10% Formol al 10% Formol al 5% Formaldehído 100 ml 0.85% so de NaCl 900 ml Diluya 100 ml de formaldehído en 900 ml de sol salina al 0.85%, también puede usarse agua destilada en lugar del NaCl Formaldehído 50 ml 0.85% so de NaCl 950 ml Diluya 50 ml de formaldehído en 950 ml de sol salina al 0.85%, también puede usarse agua destilada en lugar del NaCl

FORMOL AL 5% y 10% Preserva quistes de protozoarios, 5% Huevos y larvas de helmintos, 10% No es útil con algunas coloraciones Conservador ideal de muestras por años Inadecuado para ver trofozoítos móviles Altera la morfología de huevecillos y quistes. Microsporidias no se afectan 3:1 heces: fijador Muestras de heces más consistentes

Alcohol polivinílico PVA 100 ml de fijador de Schaudinn en vaso de precipitado de 250/500 ml Agitar la solución con barra magnética sobre porta-plato s/calentar Agregue 5 gr de PVA en polvo en el borde exterior del remolino, Continúe agitando durante 30-60’ a temperatura ambiente Obtenga una suspensión gelatinosa Caliente poco a poco hasta subir la temperatura a 70ºC Hasta disolver el PVA Es estable por varios meses, puede ser usado a temperatura ambiente o a 50ºC https://youtu.be/bXck7w-2Bso

ALCOHOL POLIVINÍLICO Efectivo cuando se mezcla con fijador de Schaudinn (HgCl2 + etanol 95º) Estándar de oro Preserva trofozoítos sin deformarlos Adecuado para transportar muestras 10 ml de fijador: 1-2 ml heces

Merthiolate-iodo-formol MIF de Sapèro y lawless Solución A: 40 partes de tintura de merthiolate Lilly® 5 partes de formaldhehído comercial 1 parte de glicerol Solución B: 5% de Yodo en 10% de ioduro de potasio acuoso Mezcle 15 partes de solución A y 1 parte de solución B inmediatamente antes de usarse Tiñe y preserva quistes y trofozoítos Tiñe y preserva huevos y larvas Inestable por el iodo 1 parte de heces por 10 partes de MIF Útil en trabajo de campo Preparación simple y bajo costo

Fenol-alcohol-formol paf 20 gr de cristal de fenol disueltos / 23 ml de fenol liquido en 825 ml de sol salina fisiológica 125 ml de etanol al 95% 50 ml de formaldehído Quistes y trofozoítos Huevecillos y larvas Heces diarreicas/ blandas con sospecha de protozoarios Examinar aún caliente las heces No es recomendable almacenar las heces en lugar caliente o a temperatura ambiente

FIJADORES Y PRESERVANTES VENTAJAS DESVENTAJAS Formol al 5% , 10% Todo propósito de fijación Fácil preparación Vida útil prolongada Preserva la morfología Apropiado para tinciones de Kinyoun, safranina y cromotrope Compatible con inmunoensayos Inapropiado para tricrómica No preserva morfología de trofozoítos Interfiere con la PCR MIF (merthiolate-yodo-formaldehído) Fijan y se pueden realizar preparaciones Fácil de preparar Vida útil larga Útil en estudios de campo Útil para estudios de concentración No es adecuada para frotis teñidos con tricrómica No preserva bien los trofozoítos de protozoarios El yodo interfiere con la fluorescencia y puede causar distorsión de los protozoarios Fijador Schaudinn Preserva trofozoítos y quistes Fácil preparación de frotis teñidos permanentes Contiene cloruro de mercurio, no adecuado para concentración Ineficiente preservación de huevos y larvas e helmintos, coccidias y microsporidios. Mala adherencia de muestras líquidas o mucosas a los portaobjetos PVA modificado cobre o zinc Se pueden preparar frotis permanentes con tricrómica Mejor zinc que cobre No cloruro de mercurio No tinción consistente Pobre morfología de quistes y trofozoítos Modificado de Rodríguez Pinheiro, T. TRANSPORTE DE MUESTRAS, 2013 curso de Enteroparasitosis humanas, Facultad de Medicina. Uruguay

FAA ALCOHOL al 70% Proglótides de Taenia spp El alcohol como fijador no interfiere para su posterior tinción. Conservan su suavidad, el formol los endurecen demasiado. Formaldehido, alcohol, y ácido acético 10%:50%:5%+35% en agua, un excelente conservador, después de fijar, Fijador de tejido vegetal Poco usado por el formaldehído

Recolección y preservación de proglótides de tenias Dar al paciente un frasco con formol No utilizar etanol, opaca la cutícula y dificulta identificación de especie. Si se utiliza agua o sol. salina entonces la muestra debe refrigerarse El agua la sol fisiológica preserva los huevecillos de Tenia, lo que se convierte en un riesgo de salud pública por la infectividad.

Categorías de heces y técnicas apropiadas Consistencia Fase más probable Solución salina Lugol para copros Azul de Metileno (trofozoítos) Formada Quistes + - Blanda Quistes, ocasionalmente trofozoítos Suelta Trofozoítos Acuosa

HECES PARA PRUEBAS MOLECULARES Conservar en alcohol absoluto Congeladas: -20ºC -80ºC

Detección de antígenos y/o ácidos nucléicos Antígenos de protozoarios en materia fecal: Seguir instrucciones del kit a utilizar (fresca, fijada o congelada) No utilizar PVA ELISA Inmunocromatografía Ácidos nucléicos Sin fijadores Enviarlas refrigeradas o congeladas mantenidas en hielo seco Puede utilizarse 1:1 etanol absoluto y enviarse refrigerada En caso de protozoarios se tiñe y se examina, si se identifica no se hace PCR

Diagnóstico presuntivo vs exámenes negativos Técnicas especiales como: Líquido duodenal Biopsias de intestino delgado o colon por endoscopía Esputo Filtrado de materia fecal Obtención de muestra por médico especialista Líquido duodenal: tubo de vidrio o plástico transparente, limpio y seco 2-5 ml Transporte inmediato al laboratorio Refrigeración a 4ºC por no más de 4 horas Biopsias: Solución salina fisiológica o paraformaldehído 4%

Envío de muestras Heces fecales

Envío de muestras. Fases Identificación Embalaje (instrucciones para el transporte de muestras) Etiquetado Documentos para envío de muestras

Identificación Nombre o clave del paciente, coincide al formato único del InDRE. Género: M- masculino F- femenino NE- no especificado Edad en años. Fecha de la toma de muestra día/mes/año Datos adicionales, Lugar donde se tomó la muestra (centro de salud, unidad hospitalaria etc) Primeros síntomas del paciente con día/mes/ año Manual para la toma, envío y recepción de muestras para diagnóstico, InDRE-2015

Transporte de muestras (embalaje) OMS, Guía sobre la reglamentación relativa al transporte de sustancias infecciosas 2011–2012. Especificaciones especiales y adicionales para los envases y embalajes de las substancias peligrosas de la división 6.2 agentes infecciosos (NOM-051-SCT2/2011) Características de las etiquetas de envases y embalajes destinadas al transporte de sustancias, materiales y residuos peligrosos (NOM-003-SCT/2008). Basados en normas internacionales y nacionales Manual para la toma, envío y recepción de muestras para diagnóstico, InDRE-2015

Sistema Triple Básico de Embalaje Colocados en gradillas o soportes que amortigüen el movimiento Recipiente primario: Tubo, frasco con tapa de rosca Hermético, a prueba de filtraciones Portaobjetos: Fresco selladas Permanentes fijadas Permanentes coloreadas En caja de portaobjetos

RECIPIENTES SECUNDARIOS Protegidos amortiguadores y absorbentes Temperatura de 4 a 8ºC Riesgo biológico “Riesgo secundario” Datos del laboratorio al que van referidos Datos de la orientación del recipiente Señal de orientación

PAQUETE EXTERNO DE ENVÍO Etiquetado del paquete externo: Riesgo Biológico Riesgo secundario Datos del remitente Datos del destinatario o receptor Señal de orientación EL LESP: Oficio de Solicitud de Diagnóstico Formato Único de Envío de Muestra Biológica Resumen de Historia Clínica Ficha de Depósito Manual para la toma, envío y recepción de muestras para diagnóstico, InDRE-2015

ETIQUETADO Recipiente primario Recipiente secundario, NOM-003-SCT/2008 Paquete externo Indicar cuantos paquetes secundarios A que laboratorio serán entregados No mezclar las muestras de cada laboratorio

ETIQUETADO DE RECIPIENTE SECUNDARIO Sustancia Infecciosa En caso de daño, derrame o fuga, AVISE INMEDIATAMENTE A LAS AUTORIDADES SANITARIAS División 6 3 medias lunas sobre circulo negro, fondo blanco Nitrógeno líquido como refrigerante. Gas NO inflamable Número 2, negro o blanco Símbolo “bombona” Riesgo secundario si se conserva a baja temperatura con dióxido de carbono (hielo seco). Leyenda varios División 9, raya inferior 7 franjas negras Sustancias peligrosas líquidas 74mm X 105mm

ETIQUETADO DEL PAQUETE EXTERNO Etiqueta de Riesgo Biológico Etiqueta de riesgo secundario en caso de proceder Etiqueta con datos del laboratorio del INDRE al que va Etiqueta de orientación del paquete Manual para la toma, envío y recepción de muestras para diagnóstico, InDRE-2015

Dimensiones mínimas establecidas Etiqueta para transporte aéreo. Dimensiones 10 x 10 cm Dimensiones mínimas establecidas Manual para la toma, envío y recepción de muestras para diagnóstico, InDRE-2015

Llenar todos los datos requeridos Letra legible Oficio de solicitud y en su caso, relación de muestras Formato único de envío de muestras REMU-F-12 Muestras: Un formato por muestra Llenar todos los datos requeridos Letra legible Se rechazará, si no tiene todos los datos Oficio a la Dirección adjunta del InDRE, con At´n a recepción de muestras Describir diagnóstico solicitado Número de muestras por diagnóstico Nombre o clave del paciente Motivo del envío: dx, referencia o Control de calidad Papelería oficial o membretada Documentos para envío Resumen de la Historia Clínica del Paciente Ficha de depósito bancaria Manual para la toma, envío y recepción de muestras para diagnóstico, InDRE-2015

… sumarizando

Examen de las heces QUÉ SÍ HACER QUÉ NO HACER: Examinar a más tardar una hora después de que se han recogido Identificar las muestras con moco, sangre, pus, de consistencia líquida y examínense rápidamente. Dejar heces expuestas al aire Que pase 2-3 horas para examinarlas Aceptar muestras de heces con orina Colocar la muestra sobre la solicitud de examen Aceptar muestras después de ingerir tratamiento medico

RECOLECCIÓN Evitar al menos 3 días antes la aplicación o toma de medicamentos o purgantes con aceite mineral o bismuto o que alteren el tránsito intestinal. Evitar alimentos que produzcan abundantes residuos no digeribles como fibras, granos, polen, frutas con exceso de semillas. Evitar muestras únicas que sólo darán un 60% de casos positivos. Muestras mucosanguinolentas o con pus, recolectarlas sin fijador y transportarlas inmediatamente al laboratorio. Muestras con gusanos adultos recoger en frascos con agua o formol.

PRESERVACIÓN Preservador más utilizado: Formol al 5% -10% Alcohol polivinílico, PVA Fenol-alcohol-formol, PAF Merthiolate-yodo-formol, MIF Generalmente se usan en proporción de 1 parte de heces por 3 partes de fijador No estar mezclado con orina u otros líquidos

transporte Utilizar frascos herméticos y de rosca En caso de requerir enviar muestras a laboratorio de referencia utilizar el sistema de triple embalaje Preferiblemente enviar la muestra separada, Formol, preserva helmintos y larvas PVA, coloraciones permanentes de trofozoítos y quistes El formol además desodoriza las muestras.

Muchas gracias por su atención