INMOVILIZACION Y ESTABILIZACION DE ENZIMAS INDUSTRIALES

1 LAS ENZIMAS COMO CATALIZADORES EN LA INDUSTRIA QUIMICA Industria Química Enzimas Enzimas para La industria Química MODIFICACIÓN y MEJORA DE SUS PROPIEDADES CIENCIAS DE LA BIOTECNOLOGIA E INGENIERIA ENZIMATICA 1

INMOVILIZACION DE ENZIMAS Enzima soluble Enzima inmovilizada S + E Re-uso ó uso continuo Mejor control de la reacción Proceso mas sencillo y mas limpio Enzima-electrodo 2

BIOTECNOLOGIA ENZIMATICA DE SUPERFICIES + E Soporte + Conservar o aumentar la actividad Mejorar la estabilidad Mejorar la selectividad 5

3 INGENIERIA DE ENZIMAS POR TECNICAS DE INMOVILIZACIÓN Y POST-INMOVILIZACION Mejorar notablemente las propiedades del biocatalizador Cual es la región que participa en la inmovilización Cuantos residuos participan en la inmovilización Utilización de brazos espaciadores Modificación química adicional Modificación física adicional 3

INGENIERIA DE ENZIMAS INDUSTRIALES ALTERACION DE ESPECIFICIDAD ESTABILIZACION REACTIVACION HIPERACTIVACION ALTERACION DE ESPECIFICIDAD

6 ESTRATEGIA GENERAL DE ESTABILIZACION DE ENZIMAS POR INMOVILIZACION COVALENTE MULTIPUNTUAL Muchos residuos de la enzima Brazos espaciadores muy cortos Soporte rígido Posiciones relativas invariables durante cualquier cambio conformacional inducido por cualquier agente distorsionarte ESTABILIZACION 3D 6 COMO CONSEGUIR ESTE TIPO DE INMOVILIZACIONES??

LA MORFOLOGIA DEL SOPORTE 7

LOS BRAZOS ESPACIADORES + - + 9

LOS RESIDUOS Y LA REGION - NH2 (muy buen nucleófilo sin necesidad de activación) .. Los grupos amino: un amino terminal muy reactivo y numerosos residuos lisina poco reactivos La región : a.- el amino mas reactivo b.- las mas ricas en grupos amino 8

INMOVILIZACION DE ENZIMAS A TRAVES DE SUS GRUPOS AMINO H2N NH3 + INMOVILIZACION DE ENZIMAS A TRAVES DE SUS GRUPOS AMINO H2N R’ + H2N R C O H O CH2 + H2N R

LA REACCION INICIAL ENTRE ENZIMAS Y SOPORTES GLIOXIL NH2 NH2 H2N pH 8.0 (NO) pH 10.0 (NO) NH2 H2N Regiones muy ricas en grupos aminos pH 10.0 (SI) 10

61 Orientacion correcta: regiones muy ricas en aminos No inmoviliza soportes muy activados a pH 7.0 No inmoviliza soportes poco activados a pH 10.0 Inmovilizacion muy rapida sobre soportes muy activados a pH 10.0 Inmovilizacion muy rapida de tripsina (autolisada) sobre soportes muy activados a pH 7.0 Efecto espectacular de la concentracion de grupos activos sobre la velocidad inmovilización Efecto espectacular de la temperatura sobre la velocidad de inmovilización Estabilización muy elevada de todas las enzimas evaluadas glioxil muy diferente de BrCN, glutaraldehido… 61

EL PROCESO DE MULTI-INTERACCIÓN ENZIMA - SOPORTE ......... Tiempo hasta 72 horas después del final de la primera inmovilización Temperatura (25 ºC >>> 4 ºC) 11

PUNTO FINAL DE LA MULTI-INTERACCION ENZIMA-SOPORTE NaBH4 1mg/ml 12

LOS GRUPOS GLIOXIL: SOPORTE-O- CH2 - CHO Muy estables y muy cercanos al soporte rígido Reacción unipuntual reversible con grupos amino a.- orientación adecuada para inmovilización multipuntual b.- multi-interacción no distorsionarte Ausencia de impedimentos estéricos .. NH2 Modificación química mínima + Soportes completamente inertes e hidrofílicos 13

14 alta densidad superficial de grupos glioxil, µEq. / m2 SOPORTES GLIOXIL PARA LA ESTABILIZACION DE ENZIMAS alta densidad superficial de grupos glioxil, µEq. / m2 Soportes formados por grandes superficies con un elevado grado de activación Brazos espaciadores muy pequeños La enzima se inmoviliza siempre por regiones muy ricas en NH2 Los grupos glioxil son muy estables y no tienen impedimentos estéricos durante la multi-interacción La modificación química de la enzima es mínima 14

16 >>> << ENZIMAS ESTABILIZADAS POR INMOVILIZACION MULTIPUNTUAL SOBRE SOPORTES GLIOXIL ENZIMA ACTIVIDAD ESTABILIZACION Tripsina Quimotripsina Penicilina G acilasa de E. Coli Penicilina G acilasa de K. citrophila Ferredoxina NADP reductasa de Anabaena Lipasa de C. rugosa Glutamato racemasa Esterasa de B. stearothermofilus Termolisina de B. thermoproteolyticus 75% 70% 60% 50% 100% 10.000 60.000 8.000 7.000 1.000 150 100 >>> estable << 16

18 Descenso del 50% en residuos lisina UNION MULTIPUNTUAL TRIPSINA (AMIN0)- 6% AGAROSA (GLIOXIL) Descenso del 50% en residuos lisina una media de 7 enlaces por molécula de tripsina HIDRÓLISIS DE BAEE RIGIDEZ ACTIVIDAD % ACTIVIDAD, % 20 40 60 80 50 100 150 200 2 4 6 8 50 100 ETANOL, % UREA, M DERIVADO UNIPUNTUAL DERIVADO MULTIPUNTUAL ESTABILIZACION ESTABILIZACIÓN TERMICA= 10.000 ACIVIDAD INTRINSECA = 75% 18

15 ESTABILIZACIÓN DE Ferredoxin NADP reductasa POR UNION COVALENTE MULTIPUNTUAL condiciones experimentales pH 7.0 , 60ºC pH 10.0 , 30ºC pH 5.0, 70 ºC pH 7.0 , 25 ºC, 50 % etanol pH 7.0 , 25ºC, etil acetato Estabilización 600 200 2000 500 Estabilidad comparada con el derivado unipuntual 15

17 INMOVILZIACION DE ENZIMAS SOBRE GELES GLIOXIL Y SOBRE OTROS SOPORTES CONVENCIONALES inactivacion de derivados de PGA inactivacion de derivados de lipasa de c. antarctica glioxil glioxil glutaraldehido bromocianogeno 17

19 ESTABILIZACION DE ENZIMAS POR INMOVILIZACION COVALENTE MULTIPUNTUAL SOBRE SOPORTES GLIOXIL Actividad – estabilidad excelente para muchísimas enzimas y todas las condiciones Los mejores resultados reportados en la literatura Protocolos de inmovilización muy sencillos Problema académico árido y multidisciplinar No se puede “ver” lo que ocurre 19

62 REACTIVACION DE ENZIMAS INMOVILIZADAS DESPUES DE SU INACTIVACION POR DISOLVENTES pH 7.0, 25ºC 90% dioxano agua ?? Estructura primaria intacta Puentes disulfuro intactos Unión covalente multipuntual Superficie del soporte inerte (-OH) 62

REACTIVACION RAPIDA Y COMPLETA replegamiento pH 7.0 25ºC agua desplegamiento Urea guanidina Disolventes Uso industrial 64

Medio acuoso 8M Guanidina REACTIVACION DE ENZIMAS INMOVILIZADAS - ESTABILIZADAS DESPUES DE SU INACTIVACION POR DISOLVENTE QT EN 90 % DIOXANO Medio acuoso Actividad residual, (%) 8M Guanidina Tiempo (dias) inactivación total reactivación 24 h. reactivación 30 min. desplegamiento- replegamiento

20 ESTABILIZACION DE ENZIMAS MULTIMERICAS IMNOVILIZACION MULTISUBUNIDADES ENTRECRUZAMIENTO CON POLIMEROS POLIFUNCIONALES (poli aldehídos) 20

21 INACTIVACION -aminoácido ester hidrolasa Actividad residual,(%) Tiempo, (horas) 5mM de fosfato sódico pH 6,5; 25ºC Concentración de proteína 5g / ml 21

36 REACCIONES CATALIZADAS POR ENZIMAS MULTIMERICAS ESTABILIZADAS EN CONDICIONES DISOCIANTES 36

37 EFECTO DE LA ESTABILIDAD DEL DERIVADO EN LA REACCION DE SINTESIS DE AMPICILINA CATALIZADA POR -aminoacidoester hidrolasa Rendimientos de síntesis de ampiccilina óptima estándar “óptima” 37 tiempo, min Condiciones estandar: 25 mM fosfato pH6,5; 4ºC Condiciones óptimas: 40% metanol pH 6,5 4ºC; ausencia de fosfato

23 Polietilenimina + dextrano sulfato  poli [ NH4 (SO4)2] ESTABILIZACION DE ENZIMAS FRENTE A DISOLVENTES GENERACION DE MICROAMBIENTES HIPERHIDROFILICOS NH3+ Enzima mas rígida Menor concentración de disolvente en el micro-entorno de la enzima SO4= Polietilenimina + dextrano sulfato  poli [ NH4 (SO4)2] 23

INACTIVACION DE PGA INMOVILIZADA POR DISOLVENTES ORGANICOS 25 50 75 100 200 400 600 800 1000 Actividad residual, (%) Tiempo (horas) 95% dixano, pH 7, 25ºC 24

UTILIZACION DE DEXTRANOS COMO BRAZOS ESPACIADORES OH HO enzima casi-idéntica a la enzima soluble ningún efecto “negativo” de la proximidad de la superficie del soporte a.- enzimas sobre substratos macromoleculares b.- cromatografía de afinidad proteína - proteína c.- proteómica (proteína-proteína, proteína-ADN..) 22

25 INGENIERIA DE ENZIMAS POR TECNICAS DE INMOVILIZACION Y POST-INMOVILIZACION Orientación // rigidez // brazo espaciador // modificaciones post-inmovilización + 25

43 PURIFICACION DE GUANIDINO BENZOATASA POR CROMATOGRAFIA DE AFINIDAD SOBRE LIGANDOS CON CARGA POSITIVA + + - + + - + + - + + - + + Intercambio iónico de numerosas proteínas Impedimentos estéricos para la afinidad de la proteína “diana” Cromatografía de afinidad selectiva y eficiente Muy baja densidad de ligandos Brazos espaciadores + Interacción fármacos y Biomacromoleculas 43

PROCESOS RELACIONADOS: BIOTECNOLOGIA DE SUPERFICIES Anticuerpos (orientaciones correctas) Sondas de ADN (alteración nula) Polisacáridos (alteración mínima) Placas multipocillo Partículas magnéticas Porta-muestras para “chips de ADN” Diagnostico Análisis alimentos Análisis de agua 49

39 INGENIERIA DE ENZIMAS POR TECNICAS DE INMOVILIZACION Y POST-INMOVILIZACION Resultados espectaculares (estabilidad, actividad, selectividad) Protocolos experimentales muy sencillos Ingeniería multidisciplinar: biotecnología de superficies + polímeros Los cambios estructurales “no se pueden ver” Avance un “poco árido” sobre una serie de evidencias experimentales... 39

53 Microbiología y biología molecular Química orgánica INGENIERIA DE LA ENZIMA Purificación, inmovilización, estabilización, hiperactivación, mejora de la selectividad, reactivación Actividad biocatalizador Estabilidad biocatalizador Ingeniería de la reacción enzimática Solubilidad substratos y productos Selectividad biocatalizador pH temperatura codisolventes Rendimientos síntesis/hidrólisis Medio ambiente Estabilidad de substratos 53

Ingeniería de la reacción Ingeniería del reactor BIOTECNOLOGIA ENZIMATICA Búsquedas de Nuevos enzimas Mejora de enzimas existentes Inmovilización purificación estabilización Ingeniería de la reacción Ingeniería del reactor Análisis, alimentos, química orgánica, medio ambiente,… PROCESOS INDUSTRIALES CATALIZADOS POR ENZIMAS

Biotecnología enzimática Multidisciplinaridad Enfoque integrado Microbiología Biología Molecular Ciencia de Materiales Química de Proteínas Bioquímica Biofísica Química analítica Química orgánica Ingeniería química Biotecnología de Superficies PROCESO QUIMICO INDUSTRIAL CATALIZADO POR ENZIMAS

IMPLANTACION DE ENZIMAS COMO CATALIZADORES INDUSTRIALES Mejora de enzimas por métodos biológicos Mejora de Enzimas por técnicas de inmovilización y post-inmovilización ingeniería de la reacción y del reactor

MEJORA DE LAS PROPIEDADES DE UNA ENZIMA INDUSTRIAL NATURALEZA Seres vivos ADN ambiental extremófilos Mutagénesis al azar Mutagénesis dirigida - más sencillas - más efectivas Inmovilización + Post-inmovilización PROCESO QUIMICO CATALIZADO POR UN ENZIMA