Ciencias y Tecnologías Químicas Curso Posgrado Ciencias y Tecnologías Químicas Procesos de Química Sostenible utilizando enzimas como catalizadores Mejora de la selectividad de enzimas

Contenido Efecto de la estrategia de inmovilización Curso Posgrado 2012 Contenido Efecto de la estrategia de inmovilización Efecto de la Ingeniería del medio Efecto de Modificación Post-Inmovilización Enantioselectividad Regioselectividad Quimioselectividad

Curso Posgrado 2012 Contenido 1. Hidrólisis enantioselectiva de esteres racemicos o proquirales precursores de fármacos 2. Desprotección regioselectiva de carbohidratos peracetilados 3. Síntesis de antibióticos β-lactamicos

Lipasas: amplio rango de sustratos Curso Posgrado 2012 Lipasas: amplio rango de sustratos

Mecanismo catalítico Conformación cerrada (inactiva) Conformación Curso Posgrado 2012 Mecanismo catalítico Medio acuoso Sitio Activo Lid abierto Lid cerrado Lid abierto Conformación cerrada (inactiva) Conformación abierta (activa) Conformación abierta Gota de grasa Zona hidrofóbica Zona hidrofílica

Lipasa de Rhizomucor miehei Curso Posgrado 2012 Movimiento del lid Cambios conformacionales en otras zonas Forma abierta Forma cerrada Lid Lipasa de Rhizomucor miehei Estructuras obtenidas del PDB. 3TGL (cerrada) y 4TGL (abierta)

Lipasa Estrategias de inmovilización Biocat6 Biocat1 Biocat5 Biocat2 Curso Posgrado 2012 Lipasa Estrategias de inmovilización Biocat6 Biocat1 Biocat5 Biocat2 Biocat3 Biocat4

Inmovilización covalente multipuntos Curso Posgrado 2012 Inmovilización covalente multipuntos Adsorción hidrofobica Adsorción física + inmovilización covalente Intercambio iónico Inmovilización covalente

Lipasa de C. antarctica (fracción B) Curso Posgrado 2012 Diferentes orientaciones de CAL-B inmovilizada Residuos hidrofóbicos Grupos carboxílicos Octil DEAE/PEI Lid Ser cat Lys amino terminal Lipasa de C. antarctica (fracción B) (CAL-B) BrCN aldehídos

Diferentes lipasas estudiadas Curso Posgrado 2012 Curso Posgrado 2012 Diferentes lipasas estudiadas Lipasa de Candida antarctica B (CAL-B) Lipasa de Candida rugosa (CRL) Lipasa de Rhizomucor miehei (RML) Lipasa de Thermomyces lanuginosa (TLL) Lipasa de Pseudomonas fluorescens (PFL) Lipasa de Páncreas porcino (PPL) Lipasa de Bacillus thermocatenulatus (BTL2) Lipasa de Thermus thermophilus (TTL) Lipasa de Thermus aquaticus (TAL) Lipasa de Alcaligenes sp (QL) Lipasa de Aspergillus niger (ANL) Lipasa de Rhizopus oryzae (PFL) Fosfolipasa LECITASA ULTRA (LECI) Lipasa de Aspergillus oryzae (AOL)

Curso Posgrado 2012 1. Hidrólisis enantioselectiva de esteres racemicos o proquirales precursores de fármacos

Resolución cinética de mezclas racémicas de esteres Curso Posgrado 2012 Curso Posgrado 2012 Resolución cinética de mezclas racémicas de esteres Enzima inicial Biocatalizador inmovilizado ee=0% ee>99% (+)-Goniodiol (S,S)-JASPIN B (3S,4R)-Paroxetine (S)-Zopiclone J.M. Palomo et al.Tetrahedron: Asymmetry. 2002,13,1337-1345. J.M. Palomo et al. Tetrahedron: Asymmetry.2005, 16, 869-874. J.M. Palomo et al. Tetrahedron: Asymmetry. 2002, 13, 2375-2381 J.M. Palomo et al.Tetrahedron: Asymmetry. 2003, 14, 429-438.

Goniodiol Mandelato de Metilo ácido 2-O-butiril-2-fenilacético Curso Posgrado 2012 Mandelato de Metilo ácido 2-O-butiril-2-fenilacético (R/S) (R/S) Centro asimétrico: donador de acilo Centro asimétrico: resto acilo Goniodiol

+ Preparación Inmovilizada Enantiómero hidrolizado ee (%) E BrCN-CAL-B Curso Posgrado 2012 25ºC, pH 7 + H2O (±)-mandelato de metilo Preparación Inmovilizada Enantiómero hidrolizado ee (%) E BrCN-CAL-B R 73 7.4 Glioxil-CAL-B 88 19 PEI-CAL-B >96 67 ee= exceso enantiomérico de producto calculado al 15% conversión; E= razón enantiomérica J.M. Palomo et al.Tetrahedron: Asymmetry. 2002,13,1337-1345.

+ Preparación inmovilizada Enantiómero hidrolizado ee (%) E Curso Posgrado 2012 4ºC, pH 9 + H2O Preparación inmovilizada Enantiómero hidrolizado ee (%) E Glioxil-BTL R 70 6 Octadecil-BTL >99 >100 PEI-BTL S 81 9 ee= exceso enantiomérico de producto calculado al 15% conversión; E= razón enantiomérica J.M. Palomo et al.Tetrahedron: Asymmetry.2003, 14,3679-3687

+ LECI: fosfolipasa LECITASE-ULTRA Preparación inmovilizada Curso Posgrado 2012 25ºC, pH 5 + H2O LECI: fosfolipasa LECITASE-ULTRA Preparación inmovilizada Enantiómero hidrolizado E Octil-LECI R >100 PEI-LECI 8 BrCN-LECI S 26 G. Fernandez-Lorente. J. Mol.Cat B: Enzym. 2008, 51,110-117

(-)-(3S,4R)-Paroxetina ()-trans-1 (3S,4R)-(-)-1 ()-trans-2 Curso Posgrado 2012 ()-trans-1 (±)-trans-4-(4´-fluorofenil)-6-oxo- piperidin-3-carboxilato de etilo (3S,4R)-(-)-1 (-)-(3S,4R)-Paroxetina ()-trans-2 (3S,4R)-(-)-3

+ Biocatalizador Enantiomero hidrolizado ees (%) E Octadecil-CAL-B Curso Posgrado 2012 45ºC,pH 7 5% disolvente + H2O ()-trans-1 (3S,4R)-(-)-1 Biocatalizador Enantiomero hidrolizado ees (%) E Octadecil-CAL-B 3R,4S/3S,4R - 1 Gluta-CAL-B 3R,4S 84 30 Glioxil -CAL-B >99 >100 Concentración de sustrato 2 mM J.M. Palomo et al. Tetrahedron:Asymmetry. 2002, 13, 2375-2381

()-5-viniloxicarboxiloxi-6- 7-oxo-5,6-dihidropirrolo Curso Posgrado 2012 Resolución de un precursor de la (+)-Zopiclona ()-5-viniloxicarboxiloxi-6- (5-cloropirid-2-il)- 7-oxo-5,6-dihidropirrolo [3,4b] pirazina (S)-4 (S)-(+)-Zopiclone ()-4

+ Biocatalizador Enantiomero hidrolizado ee (%) E Novozym435-CALB R/S Curso Posgrado 2012 25ºC,pH 7, 50% dioxane + H2O ()-5 ()-4 (S)-4 Racemization in situ Biocatalizador Enantiomero hidrolizado ee (%) E Novozym435-CALB R/S - 1 Octadecyl-CAL-B R >99 >100 Concentration of substrate was 10 mM J.M. Palomo et al.Tetrahedron:Asymmetry. 2003, 14, 429-438.

+ C18-CALB ee>99% 50 40 E>100 30 Conversión (%) 20 10 1 2 3 4 5 Curso Posgrado 2012 C18-CALB ee>99% + 50 40 E>100 30 Conversión (%) Relación volumen reacción (mL) /masa catalizador (g) : 4/1 20 10 ciclos de reacción: Conserva actividad inicial y valor de E 10 1 2 3 4 5 6 Tiempo (horas) J.M. Palomo et al.Tetrahedron:Asymmetry. 2003, 14, 429-438.

Biocatalizador Ent E Glioxil -PFL Octil-PFL 62 Curso Posgrado 2012 O H C E t C O H pH 7 + 25ºC, pH 7 (S)-Acido (±)-2-hidroxi-4-fenilbutirato de etilo PFL: lipasa de Pseudomonas fluorescens Biocatalizador Ent E Glioxil -PFL S 2 Octil-PFL 62 (S)-enalapril

E pH 7,25ºC DEAE-25L E=17 Gluta-25L E=1 25L Curso Posgrado 2012 25L Nueva lipasa de 25 kDa purificada del extracto crudo de PPL Lipasa pH 7,25ºC H2O Butirato de glicidol (R)-glicidol E DEAE-25L E=17 Gluta-25L E=1 J.M. Palomo et al. Tetrahedron:Asymmetry.2005, 16, 869-874.

Interacciones electrostáticas de las propiedades catalíticas Curso Posgrado 2012 Efecto del medio en la selectividad Interacción hidrofóbica Bolsillo hidrofóbico Interacciones electrostáticas Puentes de hidrógeno Temperatura: cambios movilidad de la enzima pH: alteración de las interacciones entre aa lid y del bolsillo receptor; superficie de la proteína Co-disolvente: exposición mas favorable del bolsillo hidrofóbico, refuerza interacciones electrostáticas MODULACIÓN de las propiedades catalíticas Pequeños cambios condiciones

CRL: lipasa de Candida rugosa Curso Posgrado 2012 H2O + 25ºC E E=1.6 E=85 pH 7 pH 5 octil-CRL CRL: lipasa de Candida rugosa J.M Palomo et al. Enzyme Microb. Technol. 2002,31,775-783.

E Jaspina B E>100 DEAE-25L E=17 (R)-glicidol Lipasa H2O Curso Posgrado 2012 Lipasa H2O Butirato de glicidol (R)-glicidol Jaspina B E>100 DEAE-25L E 10% dioxano (v/v) E=17 0% dioxano J.M. Palomo et al. Tetrahedron:Asymmetry.2005, 16, 869-874.

Desimetrización de esteres proquirales Curso Posgrado 2012 Desimetrización de esteres proquirales

Enzima HIV-1 inhibidor (S)-monometil ester Dimetil fenilglutarato Curso Posgrado 2012 Enzima (S)-monometil ester Dimetil fenilglutarato HIV-1 inhibidor

Biocatalizador Rendimiento (%) ee E BiocatLECI-1 >99 66 5.4 Curso Posgrado 2012 pH 7,25ºC Biocatalizador Rendimiento (%) ee E BiocatLECI-1 >99 66 5.4 BiocatLECI-2 80 >100 Z. Cabrera et al. Enzyme Microb Technol, 2008,43, 531–536.

Biocatalizador Actividad conversion (%) ee ROL-Lewt-pH 10 0.01 19 4 Curso Posgrado 2012 Biocatalizador Actividad conversion (%) ee ROL-Lewt-pH 10 0.01 19 4 ROL-Lewt-pH 7 0.03 18 62 Z. Cabrera, J.M. Palomo. Tetrahedron: Asymmetry. 2011, 22,2080.

ROL-Lewt-pH 7 25ºC, pH 7 Co-disolvente (%) (v/v) Activity ee (%) - Curso Posgrado 2012 ROL-Lewt-pH 7 25ºC, pH 7 Co-disolvente (%) (v/v) Activity ee (%) - 0.036 62 Dioxano 20 0.017 80 Diglime 40 0.004 83 Acetona 0.01 DMSO 0.026 72 Z. Cabrera, J.M. Palomo. Tetrahedron: Asymmetry. 2011, 22,2080.

ee (%) 5ºC, pH 7 ee=92 ee=4 Co-disolvente (%) (v/v) ee (%) - 69 Curso Posgrado 2012 5ºC, pH 7 Co-disolvente (%) (v/v) ee (%) - 69 Dioxano 20 92 Diglime 40 85 ee=92 ee (%) ROL-LewtpH 7, 5ºC, 20% dioxano (v/v) ee=4 Z. Cabrera, J.M. Palomo. Tetrahedron: Asymmetry. 2011, 22,2080.

2. Desprotección regioselectiva de carbohidratos peracetilados Curso Posgrado 2012 2. Desprotección regioselectiva de carbohidratos peracetilados

Curso Posgrado 2012

J.M. Palomo et al. Adv. Synth Cat. 2007, 349,1969-1976 Curso Posgrado 2012 -galactosa peracetilada Biocatalizador conversion [%] Actividad Rendimiento 1-OH 6-OH Biocat 1 100 0.48 99 Biocat 2 0.01 95 Biocat 3 0.02 23 15 8 Enzima: lipasa de T. lanuginosa (TLL): Biocat1: inmovilizado por interacciones hidrofóbicas Biocat 2: inmovilizado por union covalente Biocat 3: inmovilizado por intercambio ionico J.M. Palomo et al. Adv. Synth Cat. 2007, 349,1969-1976

Migración química en 1,2,3,4-Tetra-O-acetil-β-galactopiranosa Curso Posgrado 2012 Migración química en 1,2,3,4-Tetra-O-acetil-β-galactopiranosa Hexane:AcOEt 5:5 v/v Catal. Today . 2009, 140,11-18

Curso Posgrado 2012 Catal. Today . 2009, 140,11-18

Curso Posgrado 2012 2 HPLC TLC 1 pH 5 1 3 2 3 4 4 pH 8.5 2

Producción de biblioteca de productos monodesprotegidos Curso Posgrado 2012 Producción de biblioteca de productos monodesprotegidos M. Filice et al. Curr. Org .Chem. 2010,14,516-532

β-O-naftil-N-lactosamina peracetilada Curso Posgrado 2012 3 pasos β-O-naftil-N-lactosamina peracetilada M. Filice et al. J.Mol.Cat B: Enzym. 2008, 52-53, 106-112. 3 pasos Análogos de Sialyl Lewis Glicopeptidos mucina M. Filice et al. Tetrahedron. 2008, 64, 9286-9292

Curso Posgrado 2012 J.Mol.Cat B: Enzym. 2008, 52-53, 106-112. ChemBioChem 2003,4, 835-840

3. Síntesis de antibióticos β-lactamicos Curso Posgrado 2012 3. Síntesis de antibióticos β-lactamicos

Síntesis de Antibióticos b-lactámicos Semisintéticos Curso Posgrado 2012 Síntesis de Antibióticos b-lactámicos Semisintéticos Cefalosporinas semisintéticas 1º paso: Obtención del núcleo b-lactámico 2º paso: Acilación selectiva del núcleo b-lactámico. Proceso Químico + PCl5 POCl3 - HCl +2(H3C)3SiCl + 25º C - 20ºC CFC CPC trimetilsililester CPC iminocloruro - 10º C + CPC iminoester 1) -5ºC/HCl 2) H2O/+5ºC 3)Extracción con solvente/25ºC 4) OH-/Cristalización/25ºC 8 pasos produciendo 30 kg de residuos por kg de producto

b-lactámico semisintético Curso Posgrado 2012 Síntesis de Antibióticos b-lactámicos Semisintéticos 1º paso: Obtención del núcleo b-lactámico 2º paso: Acilación selectiva del núcleo b-lactámico. Cefalosporinas semisintéticas Proceso Enzimático O2 DAAO GAC NH4+ + CO2 CFC ác. Glutaril-7-ACA 7-ACA PGA Antibiótico b-lactámico semisintético 3 pasos enzimáticos, sin pasos de protección ni desprotección

Producción del núcleo b-lactámico a partir de Cefalosporina C Curso Posgrado 2012 Producción del núcleo b-lactámico a partir de Cefalosporina C Ruta enzimática actual. Principal Desventaja: + CF C DAAO Producción de H2O2 + + NH4+ CO2 Efectos muy inactivantes en las enzimas implicadas en el proceso ác. Glutaril-7-ACA GAC 7-ACA

Nueva Ruta enzimática en ausencia de peróxido de hidrógeno Curso Posgrado 2012 Nueva Ruta enzimática en ausencia de peróxido de hidrógeno CFC Co-inmovilización de DAAO y Catalasa O2 DAAO/Catalasa + NH4+ ác. a-cetoadipil 7-ACA -Eliminación del H2O2 “in situ” -Producción de productos inocuos (H2O y O2) -Mayor estabilidad de las enzimas del proceso GAC ? 7-ACA

Síntesis de antibióticos β-lactamicos Curso Posgrado 2012 Síntesis de antibióticos β-lactamicos

Producción en un solo paso de 7-ACA a partir de CFC Curso Posgrado 2012 Producción en un solo paso de 7-ACA a partir de CFC CFC 7-ACA a-cetoadipil-7-ACA glutaril-7-ACA CLEA: DAAO/catalasa CLEA: GA pH 8, 25ºC

J.M. Palomo. Curr. Org. Synth. 2009, 6,1-14 Curso Posgrado 2012 Producto Nucleo pH MeOH [%] Rendimiento 7 7-ACA 6.0 95 8 6.5 20 80 9 7-SACA 76 10 7-TACA 30 86 11 87 12 7-ZACA 74 J.M. Palomo. Curr. Org. Synth. 2009, 6,1-14

-Síntesis Termodinámicamente controlada Curso Posgrado 2012 2 Posibles estrategias: -Síntesis Termodinámicamente controlada (Catalizadores muy estables frente a disolventes orgánicos) -Síntesis Cinéticamente controlada (Catalizadores con propiedades sintéticas mejoradas)

Síntesis Termodinámicamente Controlada Curso Posgrado 2012 Síntesis Termodinámicamente Controlada enzima R-COOH + NH2 – R’ R-CONH –R’ + H2O H+ H+ Ventajas: No se requiere la activación previa de los grupos reactivos El RT es termodinámicamente estable R-COO- + N+ +NH3 – R’ Incremento del RT disminuyendo la concentración del producto no deseado: agua favoreciendo la mayor proporción posible de sustrato no ionizado Codisolventes

+ PGA Penicilina G acilasa Lentikats-CLEA CLEA S N O C H Cefalosporina Curso Posgrado 2012 S N O C H Cefalosporina 2 + AFA 7 - ADCA CH 3 G PGA Penicilina G acilasa Lentikats-CLEA CLEA 12,5 mM de 7-ADCA y 12,5 mM de AFA, a 4ºC y pH 8, 75%(v/v) de dioxano

Síntesis Cinéticamente Controlada Curso Posgrado 2012 Síntesis Cinéticamente Controlada VS + + MeOH PGA Vh1 Vh2 + MeOH + Ventajas: Condiciones suaves de reacción Altas velocidades de reacción Desventajas: Sustratos activados en forma de ésteres o amidas Rendimientos máximos transitorios Vs/Vh1( Tasa S/h1) Definen el rendimiento final de la reacción Depende de las propiedades de la PGA Vs/Vh2(Tasa S/h2)

4ºC, pH 8, 30 mM de 7ADCA y 30 mM de FAME Curso Posgrado 2012 C O M e S N H 2 + FAME 7 - ADCA Cefalosporina G CH 3 20%(v/v) de dioxano 60%(v/v) de dioxano CLEA CLEA 4ºC, pH 8, 30 mM de 7ADCA y 30 mM de FAME

Curso Posgrado 2012 PGA + (1);ácido 7-[(1-hidroxi-1-fenil)-acetamido]-3-acetoximetil-3-cefem-4-carboxílico (intermedio en la síntesis del antibiótico Cefamandol). Condiciones: 25 mM 7-ACA, 25 mM MAME 1) Fosfato 10mM, pH 6,5 2) Metanol 20%, pH 6.5 3) (NH4)2SO4 2M, pH 6.5 Metanol Fosfato (NH4)2SO4