VACUNA VIVA ATENUADA CONTRA EL COLERA

Desarrollo de la Vacuna viva liofilizada contra cólera de la cepa atenuada 638 Diseño y conducción de ensayos clínicos Estudios preclínicos Estudios de estabilidad Producción y liberación de lotes de vacunas Desarrollo Tecnológico Evaluación en voluntarios sanos Obtención de una cepa atenuada de Vibrio cholerae O1 El Tor Ogawa.

OBTENCIÓN, CARACTERIZACIÓN Y EVALUACIÓN DE CEPAS VIVAS ATENUADAS DE Vibrio cholerae Boris L. Rodríguez González, Ph. D. Departamento de Genética, CNIC.

El cólera 1. Vía entrada 2. Vence inm. natural 3. Coloniza 4. Enfermedad diarrea + vómitos acidosis dolores musculares choque hipovolémico El cólera 3. Coloniza (produce enterotoxina) 1. Vía entrada 5. Excreción ( 1 L/día) 2. Vence inm. natural

Racionalidad vacunas vivas de cólera 1. Vacuna contra el cólera El Tor inexistente. 2. Protección en convalescientes  3 años. 3. Toxina colérica requisito para el cólera gravis. 4. Immunidad antibacteriana protectora. 5. Inmunidad antitoxina superflua. 6. Desconocimiento de la combinación de Ag Protectores. 7. Vacunas muertas: EP = 60% (exc niños), 2 - 3 dosis.

DISEÑO EXPERIMENTAL PARA OBTENER CEPAS DE V. cholerae DE GENERACIÓN 1 Deleción del profago CTXΦ Cepas patógenas de V. cholerae Estrategia E.coli SM10pir (donante 1) Genes de CTXΦ Conjugación Pases y Selección V cholerae C7258 El Tor Ogawa V cholerae C6706 El Tor Inaba

Remoción de CTX . Eventos moleculares P C1 C2 S1 C6706 C7258 C671 C673 C723 C678 C674 C728 413 417 81 82 84 87 88 LBPA: C67 (1...10) C72 (1...10) Kb  A B C D E 10 pases en LB 23,1 9,4 6,5 4,3 1000 colonias Amp sensibles= 70 LBP y LBPA 2,3 No. 2 No. 1 SONDAS

DISEÑO EXPERIMENTAL PARA OBTENER CEPAS DE V. cholerae DE GENERACIÓN 2 Inserción del gen celA en el gen de la hemaglutinina proteasa Cepas de generación 1 de V. cholerae Estrategia E.coli SM10pir (donante 2) Conjugación Pases y Selección Hemaglutinina proteasa cel A Cepas de Generación 1 81 y 413

Obtención de CGM de V. cholerae por reemplazamiento hap por hap::celA S1 81 413 61,4,9,10 63 131...10 631 638 1332 1333 LBPA: 6 (1...10) 13 (1...10) Kb  A B D E 1000 colonias LBP y LBPA 10 pases en LB 23,1 9,4 6,5 4,3 2,3 Amp sensibles= 21 SONDAS No. 3 No. 4

Niveles de toxina colérica en las cepas progenitoras y modificadas

Detección de la hemaglutinina proteasa (Hap) en las cepas progenitoras y genéticamente modificadas Ensayo de ‘Western blot’ Carriles 1: C7258 2: 81 3: 631 4: 638 5:C6706 6:413 7:1333 La detección de Hap fue realizada con una preparación de anticuerpo policlonal anti-Hap obtenido en conejo. (Anticuerpo donado por el Dr. Richard Finkelstein)

Detección de la actividad celulolítica de las cepas vacunales de V Detección de la actividad celulolítica de las cepas vacunales de V. cholerae de generación 1 y 2 C A: Western blot con anticuerpos policlonales anti Cel A obtenidos en conejo: Carriles: 1(413); 2 (1333), 3 (81); 4 (631; 5 (638) B: Actividad celulolítica de las cepas vacunales en geles de poliacrilamida (geles de Beguin) C: Actividad celulolítica de la cepa 638 en placa petri

DISEÑO EXPERIMENTAL PARA DETERMINAR LA DOSIS DE TRABAJO CON LAS CEPAS VACUNALES DE GENERACIÓN 1 Y 2 9 grupos de ratones balb/c lactantes fueron inoculados con las cepas de V. cholerae que se indican y a las dosis señaladas Cepa C6706 Cepa C7258 103 104 105 N = 12 N = 81 N = 90 N = 39 N =113 Inóculo Vehículo N = 39 Controles Se deteminó la sobevivencia de los animales en los grupos y se compararon entre si. Se empleó el método de log Rank

Selección de la dosis de trabajo Conclusión La dosis 105 UFC de C6706 o C7258: 100 x dosis letal 100%

Se determina la sobrevivencia DISEÑO EXPERIMENTAL PARA EVALUAR LA VIRULENCIA Y LA CAPACIDAD DE COLONIZACIÓN DE LAS CEPAS VACUNALES DE GENERACIÓN 1 Y 2 Cepa 413 Cepa 1333 Cepa 81 Cepa 631 N = 75/grupo Cepa 638 GRUPOS Diseño Se inoculan los ratones Balb/c lactantes con la dosis de trabajo (105 UFC) Se divide cada grupo en dos subgrupos Subgrupo 1: Se determina la sobrevivencia Subgrupo 2: Se determina la capacidad de colonización del intestino delgado UFC/cm2

Virulencia y colonización de las CGM (Dosis 105) -Panel superior: Virulencia. Gráfico de Kaplan-Meier -Panel inferior: Colonización en intestino delgado

Efecto de dos formulaciones sobre la viabilidad de dos cepas liofilizadas Log UFC/mL1-Log UFC/mL2 F13 F94 638 0.76 0.64 CVD103-HGR 0.86 0.71 1 Log UFC/mL antes del proceso de liofilización. 2 Log UFC/mL después del proceso de liofilización. 3 Formulación compuesta por: lactosa, peptona bacteriológica y sorbitol. 4 Formulación compuesta por: leche descremada, peptona bacteriológica y sorbitol.

PERDIDA DE VIABILIDAD DE LA CEPA 638 EN DOS FORMULACIONES Y EN DIFERENTES TIEMPOS

Anticuerpos Monoclonales y Métodos de Detección AcM Isotipo Especificidad Utilidad 1G10G5 IgG2a CT-A, reacciona con CT-1 (toxina de V. cholerae O1, clásica) y CT-2 (toxina de V. cholerae O1, El Tor). GM-1 ELISA Western Blot 4D1G5 CT-B, REACCIONA CON CT-1 (TOXINA DE V. CHOLERAE O1, CLÁSICA) Y CT-2 (TOXINA DE V. CHOLERAE O1, EL TOR). GM-1 ELISA Western Blot 2F12F1 IgG3 MSHA de cepas de V. cholerae O1 y O139. ELISA Wester Blot 10E10E1 TCP DE CEPAS DE V. CHOLERAE O1 (BIOTIPOS CLÁSICO Y EL TOR) Y CEPAS DE V. CHOLERAE O139. 4D6F9 IgG1 TCP DE CEPAS DE V. CHOLERAE O1 (SOLAMENTE BIOTIPO EL TOR) Y CEPAS DE V. CHOLERAE O139. 6G1E12F1 LPS de V. cholerae O1 (serotipos Ogawa e Inaba), no reacciona contra LPS de cepas de V. cholerae O139. ELISA, Wester, Aglutinación y Vibriocida 4D2G5 IGg2b LPS de V. cholerae O1 (serotipos Ogawa e Inaba), no reacciona contra LPS de cepas de V. cholerae O139 ELISA, Wester, y Vibriocida 2B4 LPS de cepas de V. cholerae O1 (solamente serotipo Ogawa), no reacciona contra LPS de cepas de V. cholerae O139 9A11D6 LPS de cepas de V. cholerae O139, no reacciona contra LPS de cepas de V. cholerae O1

PATENTE CONCEDIDA

PATENTE CONCEDIDA

Dirección de Vacunas Bacterianas. www.finlay.sld.cu ENSAYOS CLÍNICOS EN VOLUNTARIOS SANOS CON INÓCULO FRESCO DE LA CEPA ATENUADA 638 DE Vibrio cholerae Luis García Imías Ph. D. Dirección de Vacunas Bacterianas. www.finlay.sld.cu lgarcia@finlay.edu.cu Habana, Cuba.

Objetivo Demostrar el potencial de la cepa 638 como cepa vacunal contra el cólera. Diseño Voluntarios sanos de 18 a 40 años hospitalizados en la Sala de Aislamiento Clínico del IPK. Estudios a doble ciego (vacuna-placebo) con 18 voluntarios por ciclo. Una sola dosis administrada por vía oral. Dos semanas de seguimiento en la sala de aislamiento. Tratamiento con antibiótico antes de abandonar la sala.

Vacunados Placebos Total País EVALUACIÓN CLÍNICA DE LA CEPA 638 Estudios de reactogenicidad e inmunogenicidad en voluntarios Vacunados Placebos Total País 77 46 123 Cuba 26 19 45 Ecuador 103 65 168

REACCIONES ADVERSAS LUEGO DE LA INGESTIÓN DE LA CEPA VACUNAL 638 Los efectos adversos inducidos por la cepa 638 fueron leves y de escasa duración. Se presentaron 4 casos con diarrea reactogénica entre los vacunados (8%) y un caso en el grupo placebo, en los estudios realizados en Cuba. En los estudios realizados en Ecuador no se presentó diarrea entre los vacunados mientras ocurrió en un voluntario placebo. La sintomatología presentada no interfiere con las actividades normales del vacunado. Tanto en la diarrea como en el resto de los síntomas no se encontraron diferencias significativas entre el grupo vacunado y el placebo.

RESULTADOS DE INMUNOGENICIDAD

Subdirector del Instituto de Medicina Tropical “Pedro Kourí” Ensayo de eficacia protectora del candidato vacunal Dr. Manuel Díaz Jidy Subdirector del Instituto de Medicina Tropical “Pedro Kourí” jidy@infomed.sld.cu Habana, Cuba.

Antecedentes Primera vez que se realiza en Cuba. Hacerlo directamente en humanos. Producir un infección experimental potencialmente mortal en voluntarios. No existe la enfermedad en el país.

Objetivos Garantizar la salud de los voluntarios participantes. Valorar la eficacia protectora de la cepa 638. Evaluar la reactogenicidad e inmunogenicidad. Impedir escape al medio ambiente del producto vacunal y/o la cepa viva virulenta con que se retó.

DISEÑO DEL ESTUDIO DE RETO 21 Voluntarios 18 - 40 años 12 voluntarios 9 voluntarios 1-9 x 10 9 UFC cepa Placebo Un mes después Un mes después Cepa de reto 3008 10 6 UFC (12 V and 9 P) Seguimiento síntomas clínicos durante 5 días EFICACIA PROTECTORA

Incidencia de diarrea después de la administración Resultados Incidencia de diarrea después de la administración de la cepa del reto La cepa 638 mostró una eficacia protectora del 100 %. Grupo 1 (vacunados) N=12 Grupo 2 (placebo) N=9 0 (0.00 %) 7 (77.7 %) La cepa 638 resultó segura, no reactogénica e inmunogénica. No se evidenciaron escapes de la vacuna, ni de la cepa virulenta al medio ambiente.

Impacto Científico Este estudio constituyó la prueba indispensable para determinar la selección de la cepa atenuada 638 como ingrediente farmacéutico activo dentro de la vacuna contra el cólera, del serotipo y biotipo de mayor interés epidemiológico en el mundo. Estos ensayos prestigian la capacidad de Cuba en la validación de vacunas y nos permite continuar investigaciones cada vez más complejas.

Gerencia de Proyectos. www.finlay.sld.cu DESARROLLO TECNOLÓGICO FARMACÉUTICO DE LA VACUNA VIVA ATENUADA CONTRA EL CÓLERA Lic. Yilian Plasencia Gerencia de Proyectos. www.finlay.sld.cu yplasencia@finlay.edu.cu Habana, Cuba.

Desarrollo Farmacéutico Transferencia de Investigación a Desarrollo Desarrollo de una tecnología de obtención a escala piloto del preparado vacunal Medios de cultivo de diferentes proveedores Microbiología Optimización de los parámetros de cultivo Tiempos de esterilización Velocidades de agitación Volúmenes de cultivo Aireación superficial sumergida Flujos de aire Fermentación

Centrifugación Selección del método de separación celular Filtración tangencial Selección de lioprotectores Parámetros de liofilización Establecimiento de una tecnología de liofilización Establecimiento de una tecnología de producción Adecuación del área y obtención de la licencia de producción del CNSB

Producción y liberación de lotes de vacuna Colonización Inmuogenicidad Batería de caracterización Ensayos de liberación de lotes Definición del desarrollo analítico (control de calidad) Pureza Identidad Seguridad Viabilidad Inmunogenicidad Toxicidad Preclínica Consistencia Estabilidad Otros estudios

Elaboración de la documentación Tramitación de solicitud de autorización para el inicio de los ensayos clínicos Inocuidad frente a Vibrio cholerae Evaluación capacidad tampón Evaluación de su disolución Estudio de estabilidad Obtención del antiácido Confección del protocolo del ensayo clínico Diseño y conducción de un ensayo clínico fase I – II en Cuba

Vacuna viva atenuada contra cólera Producto liofilizado. Es una vacuna de células enteras de Vibrio cholerae que se reconstituye con un antiácido en 100 mL de agua natural, lista para su uso inmediato Forma farmacéutica Vía de administración Oral Bulbo conteniendo una dosis Estuche conteniendo el antiácido Presentación Vaso conteniendo 100mL de agua natural Dos procesos semanales de 10L, con un rendimiento de 1192 dosis Capacidad productiva

Fin