Electroforesis José A. Cardé, PhD Lab Biol 4019 Biología Celular-Molecular Universidad de Puerto Rico-Aguadilla

Objetivos Luego de haber completado el ejercicio, el (la) estudiante estará capacitado para:  1. Distinguir entre una electroforesis utilizando geles de poliacrilamida y una electroforesis utilizando geles de agarosa. 2. Describir los diferentes parámetros que influyen en la separación de los fragmentos de DNA. 3. Preparar un gel de agarosa y separar fragmentos de DNA en el mismo. 4. Estimar el peso molecular de los fragmentos de DNA productos de la digestión con endonucleasas de restricción.

Introducción Separar y analizar moléculas: ELECTROFORESIS Arne Tiselius 1937 (Nobel 1948) ELECTROFORESIS DE ZONA MATRIZ (que retiene las moléculas) ánodo cátodo SOPORTE + - ELECTROFORESIS Separar y analizar moléculas: Proteínas ADN/ARN Arne Tiselius 1937 (Nobel 1948) ... en función de su diferente carga eléctrica. Moléc. +  cátodo (-) Moléc. -  ánodo (+)

Factores que afectan la mobilidad 1 Campo eléctrico Diferencia de potencial (V-voltios): bajo voltaje (10-500 V) alto voltaje (500-10000 V) Intensidad (A-amperios): flujo de carga eléctrica. depende de V y de R. Resistencia: determinada por el soporte. Temperatura: efecto joule  refrigerantes 2 Muestra Carga o densidad de carga: carga eléctrica/masa de la molécula Tamaño: debido al poro de la matriz. Forma: forma globular vs lineal: avanza más. 3 Amortigudor pH: determina el grado de solvatación y la carga de las moléculas generalmente es ligeramente básico  moléc. - Fuerza iónica: generalmente 0.05 o 0.1 M para que no interfiera 4 Soporte - friccion Adsorción Porosidad molecular

Matrices Electroforéticas Características: Gel poroso (tridimensional interno). Tiene que permitir el paso de moléculas. NO puede estar cargado. Matriz de l gel Tipos de Soporte (no restrictivo o restrictivo): Electroforesis de proteínas Electroforesis de DNA/RNA no restrictivo (grupo I): papel, almidón, agar, acetato de celulosa. * poro >>> proteínas. * separación sólo por CARGA restrictivo (grupo II): acrilamida * poros = proteínas * separación por CARGA y TAMAÑO restrictivo (grupo II): acrilamida, agarosa * poros = moléculas de DNA/RNA * separación sólo por TAMAÑO

PAGE – Gel de Poliacrilamida Soporte: (restrictivo) :Poliacrilamida * Polimerización de dos componentes: Acrilamida + Bisacrilamida * Variación de la concentración  variación del tamaño de poro Electroforesis vertical Ventajas: * Gran poder de separación(resolución) por CARGA y por TAMAÑO. * Químicamente inertes. * Transparentes (densitograma). * Estables (pH, fuerza iónica, temperatura). * Versatilidad en cuanto al tamaño de poro.

PAGE – Gel de Poliacrilamida Aplicaciones: Separar proteínas Determinar peso molecular de una proteína Separar proteínas oligoméricas Separar proteínas en función de su pI Separar proteínas de mezclas muy complejas Ver si hay una proteína en concreto SDS-PAGE Electroenfoque Electroforesis 2D Western Blot

Gel de Agarosa – Acidos Nucleicos Soporte: (restrictivo) * Geles de Agarosa  moléculas grandes (0.1-60 kpb) * Geles de Poliacrilamida  moléculas pequeñas (6-2000 pb) Electroforesis horizontal (agarosa) o vertical (poliacrilamida) Separación por TAMAÑO DNA - Densidad de carga igual para todas las moléculas por los grupos PO4-

Geles de Agarosa Aplicaciones: Separar, identificar y purificar fragmentos de DNA o RNA. Determinar tamaño de un fragmento de DNA. Separación de cromosomas enteros Secuenciación de DNA. Identificación de regiones de unión a proteínas. Detectar la presencia de un gen (o secuencia específica de DNA) en una muestra. Determinar si se expresa un gen específico Geles de agarosa Geles poliacrilamida Southern Blot Northern Blot

Geles de Agarosa Soporte: (restrictivo) Agarosa Electroforesis horizontal muestra (-) + - Campo eléctrico (DV) Preparar el gel. Aplicación de la muestra. Electroforesis. Detección por tinción con Bromuro de Etidio (BrEt): se intercala en el DNA y al irradiarlo con luz UV emite fluorescencia.

Rango de separación por % agarosa GM Varela Agront, PhD, MPH

Southern Blot * Interacción DNA-DNA (complementación). * Detectar en una mezcla una secuencia de DNA específica (muy sensible). * Detectar la presencia de un gen, etc. e- 4. Revelado DNA interés 32P 1. Electroforesis en geles de agarosa moléculas de DNA 2. Transferencia a membrana moléculas de DNA Gel Agarosa Southern BLOT Todas los DNA de interés 5. Resultado 3. Hibridación con la sonda radioactiva DNA interés …ATTGCA… …TAACGT… Sonda de DNA 32P

Northern Blot * Interacción RNA-DNA (hibridación). * Detectar en una mezcla una secuencia de RNA específica (muy sensible). * Expresión génica. e- 4. Revelado RNA interés 32P 1. Electroforesis en geles de agarosa moléculas de RNA 2. Transferencia a membrana moléculas de RNA Gel Agarosa Northern BLOT Todas los DNA RNA de interés Resultado 3. Hibridación con la sonda radioactiva RNA interés …AUUGCA… …TAACGT… Sonda de DNA 32P

Determinación de Peso Molecular Marcadores de peso molecular: * Mezcla de diferentes proteínas pre-teñidas de las que conocemos el peso molecular. * Por comparación y extrapolación podemos averiguar el PM de nuestra proteína.

Peso Molecular - El peso molecular del DNA puede ser determinado utilizando la electroforesis en geles de agarosa. Los fragmentos de DNA es necesario correr junto a las muestras un marcador molecular estándar. El marcador molecular estándar posee de 5 a 10 fragmentos de DNA a los cuales se le conoce el peso molecular. - Existe una relación lineal entre el logaritmo del peso molecular de las moléculas y la distancia recorrida en el gel. Esta relación permite crear una curva estándar de la distancia de migración versus el log10 del peso molecular de los fragmento de DNA que se encuentran en el marcador molecular estándar. Esta curva estándar es utilizada para extrapolar el peso molecular de aquellos fragmentos de DNA en estudio.

Para crear la curva estándar es necesario: 1)   Medir la distancia desde el punto de partida (fosas) del marcador hasta cada una de las bandas observadas en el marcador. Se repite lo mismo con los fragmentos de DNA en estudio. 2)   Determinar el log10 del peso molecular de los fragmentos de DNA que se encuentran en el marcador estándar y trazar en el eje de Y utilizando papel de gráfica regular. 3)   Trazar la distancia recorrida en el eje de X. Al terminar la gráfica se observa una línea.  4)   Utilizar la distancia recorrida por las muestras y extrapolar a la línea para determinar el peso molecular.

Tabla 1: Marcador Molecular kilobases distancia (mm) log kb 5.148 8 0.7116 4.268 13 0.6302 3.53 14 0.5478 1.904 21 0.2797 1.584 23 0.1998 1.375 25 0.1383 0.947 29 -0.0237 0.831 30 -0.0804 0.564 34 -0.2487 Tabla 2 Endonucleasa de Restricción   Nombre ER distancia (mm) log kb antilog kb pares bases Bgl1 34 -0.224 0.597 597 41 -0.4915 0.322 322 b) Para calcular KB Calcular el Antilog kb = antilog -0.224 = 0.597 c) Calcular pb 1kb = 1,000 pb 0.597 kb = 597 pb a) Para calcular el PM muestra: Ej. Log kb Log kb = -0.0382x + 1.0747 x= distancia ER -0.0382(34) + 1.0747 = -0.224 GM Varela Agront, PhD, MPH

Gel de Agarosa: Peso Molecular

Gel de Agarosa: Peso Molecular

Preparación de Gel Preparación del gel de agarosa al 1% 1. Pese 0.5 g de agarosa y colóquelos en un matraz de 200 ml. Añada 50 ml de amortiguador de la corrida (TBE 1X). 2. Cubra el matraz con un pedazo de papel de aluminio para evitar la evaporación del amortiguador. 3. Coloque el matraz en una hornilla y caliente hasta que toda la agarosa se haya disuelto. 4. Remueva el matraz de la hornilla y déjelo enfriar hasta 65ºC. Añada 2 µl de bromuro de etidio (10 mg/ml). 5. Selle bien el molde y vierta la agarosa liquida y espere que se solidifique.

Electroforesis de Agarosa Sellar molde para la gel con cinta adhesiva Asegurarse que este bien bien sellada Disolver 0.8 g de agarosa en 100ml de TBE (8%) Derretir en microondas con incubaciones de 30 segundos hasta que hierva y no se vean partículas flotando Dejarla bajar a 55C-60C y servirla en el molde sellado, colocar peinilla remover burbujas* * Añadir 1-2µl de EtBr (opcional) EtBr para visualizar bandas al final Mutagenico Fluorescente

Electroforesis Dejar solidificar por 10 –15 min, la gel se vera opaca Colocar la gel en la camara vacía Añadir buffer de corrida TBE hasta cubrir los pozos completamente Remover la peinilla Servir las muestras en un orden predeterminado

Preparacion de Muestra Preparación de la Muestra 6. Coloque 15 µl de la muestra de DNA cortado con las endonucleasas de restricción en un microtubo de 500 µl. Añada 5 µl de amortiguador de la muestra (“loading buffer”). 7. Coloque 15 µl de la muestra del DNA sin cortar con las endonucleasas de restricción en un microtubo de 500 µl. Añada 5 µl de amortiguador de la muestra. 8. Coloque los dos tubos en hielo hasta que vaya a servir las muestras en el gel.

9. Coloque el gel de agarosa dentro del tanque de electroforesis.    10. Añada el amortiguador de la corrida (“running buffer”) al tanque de electroforesis. Asegúrese de cubrir el gel completamente. 11. Utilizando una pipetta de 1-10 µl, añada 5 µl del marcador molecular estándar a la primera fosa del gel. 12. Utilizando una pipetta de 10-100 µl, añada los 20 µl de la muestra de DNA cortado con las endonucleasas de restricción (preparada en la parte anterior) a la segunda  fosa del ge.

13.Coloque los 20 µl de la muestra de DNA sin cortar con las endonucleasas de restricción  (preparada en la parte anterior) a la tercera fosa del gel.   14.Continué con el paso 4 y 5 para cada grupo de trabajo. 15.Coloque la tapa del tanque de electroforesis y conéctela a la caja de electricidad. Verifique que los polos estén correctamente conectados.  16.Corra la electroforesis a 80 V por 1 hora.

Electroforesis Conectar el power supply 50-100 V y correr la gel por 45-75 minutos Remover la gel y observarla en lampara de luz UV Fotografiar y medir distancia de las bandas en la gel Preparar gráfica de distancia (X) vs log10 del peso molecular (o bp, (Y)

Observación de Resultados Observación de los resultados Luego de la hora apague la caja de electricidad. 18. Saque el gel de agarosa. Con mucho cuidado colóquelo sobre la lámpara de luz ultravioleta.   19. Utilizando una regla mida las distancias entre las fosas y las diferentes bandas observadas.

Referencias http://www.austincc.edu/mlt/mdtech/dnalabssemilogplotting.pdf https://www.addgene.org/plasmid-protocols/gel-electrophoresis/ https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4846332/