LA TRANSCRIPCION EN EUCARIOTAS   Pregunta 1: ¿Qué inicia la transcripción en eucariotas? ·       Factores accesorios ·       RNA polimerasas Pregunta 2: ¿Cómo se inicia la transcripción? ·       Diseño de promotores Diseño de intensificadores

GENERALIDADES   ·       Genes clasificados por sus promotores y transcritos por una polimerasa diferente ·       RNA pol I: rRNA ·       RNA pol II: mRNA ·       RNA pol III: tRNAs y snRNAs ·       Factores accesorios se requieren para iniciar la transcripción ·       Factores accesorios son los responsables de reconocer los promotores para la transcripción ·       Factores generales: inicio sínteis RNA, forma aparato transcripción basal ·       Factores upstream: incrementan eficacia de la iniciación de la transcripción ·       Factores inducibles: regulan la transcripción ·       Regulación positiva y específica de tejido

PROMOTORES E INTENSIFICADORES CONTRIBUYEN A LA TRANSCRIPCIÓN EUCARIOTA

· Promotores localizados upstream del punto de inicio RNA polimerasa I   ·       Promotores localizados upstream del punto de inicio ·       Reconoce un conjunto limitado de promotores ·       Promotor bipartito ·       Núcleo del promotor 45 a +20 ·       Suficiente para iniciar transcripción ·       Elemento de control UCE 180 a 107 ·       Incrementa eficiencia transcripción ·       Factores accesorios ·      

FUNCION DE RNA Pol I UBF1 se une a zona GC en núcleo promotor y UCE SL1 se une cuando UBF1 esta unida Confiere especificidad de especie Cuatro proteínas: TBP (conservada e interacciona con RNA pol I) Posiciona a RNA pol I en punto de inicio (como el factor s) RNA pol I se une cuando UBF1 y SL1 están unidas

RNA POL III Dos tipos de promotores Para tRNA 5S : dowstream +55 a +80   Para tRNA 5S : dowstream +55 a +80 Para snRNA: upstream Promotores de RNA pol III pueden estar por upstream y downstream del punto de inicio Como siempre: función del promotor elemento cisacting reconocido por factores de transcripción  Tres organizaciones de promotores (bipartitos) identificadas Caja TATA confiere especificidad y elementos upstream (PSE y OCT) eficacia

FUNCION RNA POL III Tres TFIIIX involucrados en el inicio de la transcripción TFIIIA proteína con dominios de dedos de zinc TFIIIB complejo de TBP y 2 proteínas TFIIIC complejo de 500 kD (5 subunidades) Se requiere unión de TFIIIA y TFIIIC (factores de ensamblaje) para que se una TFIIIB en caja TATA seguida de RNA pol III. TFIIIB actua como factor de posicionamiento de la RNA pol III (TBP reconoce caja TATA)

RNA polimerasa II · Compuesta de muchas subunidades (500 kD)   ·       Compuesta de muchas subunidades (500 kD) ·       La subunidad más grande tiene un dominio carboxilo terminal (CTD) con secuencias consenso repetidas de 7aa ·       El CTD puede ser fosforilado ·       Interacciona con gran variedad de promotores ·       RNA pol purificada puede transcribir plantillas de DNA, pero es incapaz de iniciar la transcripción en promotores específicos ·       RNA pol II depende de factores auxiliares: los factores de transcripción TFIIX (X=A,B,C,D,F,G,….) ·       RNA pol II + TFIIX = Aparato basal de la transcripción  ·       Dos regiones esenciales del promotor  ·       El iniciador (Inr) Py2CAPy4 (3 a +5) ·       La caja TATA centrada en 25 ·       Formada por 8 pb ·       Rodeada de GC

¿Cómo inicia la transcripción RNA pol II?­ Etapa 1: unión de TFIID a la caja TATA   ·       ¿Quién es TFIID? Complejo (800 kd) formado por:  TBP (30 kD): se une a caja TATA  Factor de compromiso Coloca a RNA pol II Permite poner juntos TFIIX y RNA pol II  ·       TAFs : reconocimiento promotor?? ·       TAF250 y TAF150 interaccionan con DNA en pto inicio: eficacia Etapa 2: unión de TFIIA seguida de TFIIB Etapa 3: unión de TFIIF y RNA pol II RAP74: Función helicasa ·       RAP38: interaccion con RNA pol II Requeridos para liberar promotor y permitir reacción de elongación

Etapa 4: Unión de TFIIE, TFIIH y TFIIJ Etapa 5: TFII H actividad helicasa y quinasa (fosforila CTD de pol II)  

VISUALIZACION TRIDIMENSIONAL DEL COMPLEJO EN DNA

¿Cómo esta organizado un promotor?   Trescuatro regiones claramente identificadas por mutagénesis ·Caja TATA (25) componente menos efectivo!  Caja CAAT (75) afecta eficacia de la transcripción, no especificidad en promotor Caja GC (90) GGGCGG une factor SP1 y afecta eficacia de la transcripción

No hay generalidad en cuanto a la localización de las cajas/elementos. Caja Oct menos conservada, papel regulador (especificidad de especie)   Conclusión: las interacciones proteínaproteína juegan un papel importante en el inicio de la transcripción en eucariotas Regulación de la localización y de la frecuencia

Y la complejidad aumenta…. Los intensificadores Incrementan la actividad de los promotores Conjunto de elementos localizados a distancia variable del promotor (upstream o downstream) No funcionan unidireccionalmente Pueden estimular cualquier promotor situado en su vecindad Preeven parte del circuito regulatorio de la transcripción ¿Cómo estimula el amplificador la iniciación? Aumentar la concentración de TFs cerca del promotor por cambiar la estructura del DNA En realidad, todavia es una ???

Mutación de los intensificadores afecta la eficacia de transcripción eucariota

Los factores de transcripción contienen dominios independientes

La integridad de los dominios y las interacciones proteína-proteína son indispensables para la activación génica

EL CONCEPTO DE DOBLE HIBRIDO Los dominios pueden separarse y mantienen la capacidad de activar la transcripción se se re-establece su interacción EL CONCEPTO DE DOBLE HIBRIDO Activación génica Interacciones proteína-proteína