Seminario 6 2006 – Human Mediator enhances basal transcription by facilitating recruitment of TFIIB during PIC assembly (Baek, Kang, Roeder) Mediador mejora.

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1 Seminario 6 2006 – Human Mediator enhances basal transcription by facilitating recruitment of TFIIB during PIC assembly (Baek, Kang, Roeder) Mediador mejora la transcripción basal por la facilitación del reclutamiento de TFIIB en el ensamblaje del PIC

2 Transcripción ARN polimerasa II Factores de Transcripción Generales (GTFs): TFIIA, TFIIB, TFIID, TFIIE, TFIIF y TFIIH Necesarios y suficientes para transcripción basal de templados de DNA con TATA y para la formación del PIC

3 Ensamblaje del PIC Estructura del complejo TBP-TATA

4 Formación del PIC: Dos modelos
Modelo de Holoenzima Ensamble secuencial

5 Mediador Es un coregulador general de la transcripción
HEAD MIDDLE TAIL CDK Es un coregulador general de la transcripción Compuesto por distintas subunidades y dominios Conservado en todos los eucariotas Forma complejos con RNA pol II

6 Mediador Aumenta nivel de transcripción basal (cooperatividad con TFIID en ensamblaje y estabilización del PIC y en la reiniciación de transcripción en levaduras) Estimula actividad kinasa de TFIIH en el CTD de Pol II necesario para la transcripción basal y la formación del PIC dependiente de activador Interacciones con la pol II y los GTFs facilitan la formación y función del PIC

7 Mediador interaccionando con la maquinaria basal de la transcripción
La cola de CTD no fosforilada está asociada al mediador y a componentes de la maquinaria de iniciación La fosforilación parcial de la cola de CTD hace que tanto el mediador como los GTFs se separen

8 Mediador No esencial para transcripción basal in vitro con RNA pol II y GTFs purificados Necesario para transcripción basal en extractos nucleares y para transcripción activada  ¿es coactivador, contrarresta la presencia de algún inhibidor o las condiciones in vivo son más restricivas? Compensa la presencia de GTFs en niveles limitantes, o de inhibidores

9 Paper Estudio de la interacción Med – TFIIB Hipótesis:
Mediador recluta y estabiliza PIC facilita fosforilación de CTD Preguntas: ¿El ensamblaje del PIC en extractos nucleares es igual que con TFs purificados? ¿TFIIB tiene un efecto de reclutamiento similar al del Mediador?

10 Materiales Extracto nuclear HeLa inmunodepletado de GTFs y Mediador (tratamiento con anticuerpos, crosslinking, agregado de anti-anticuerpos y precipitación) GTFs y Mediador con tags de His o epítopes, expresados en bacterias y purificados Templados de ADN biotinilado con o sin TATA + bolitas de Streptavidina-Sefarosa

11 Materiales SDS PAGE de dos preparaciones de Mediador Purificado
FLAG-tags  epítopes

12 Métodos Templados inmovilizados ↓
Preincubación con extracto nuclear y GTFs Lavado Incubación con Mg2+, NTPs ↓ Electroforesis Phosphorimager nivel de transcripción corte EcoRI Western Blot (Immunoblot) ↓ Unión de GTFs o Mediador

13 Resultados Templados + NE(IID/ Med) + TBP (TATA Binding Protein) + Med (variable) Unión no específica TFIIH y TFIIF Mediador  papel importante en reclutamiento de, al menos, TFIIB TFIIE y Pol II UNIÓN TATA DEPENDIENTE UNIÓN MED DEPENDIENTE

14 Resultados Aumento >9x (TATA+ vs TATA-) Aumento >5x (TATA+Med+ vs TATA+Med-) = Aumento 49x con TATA y Med Correlación entre reclutamiento Med-dependiente de GTFs y Pol II y nivel de la transcripción basal

15 Resultados Comparación temporal (preincubación por tiempos variables, templado con TATA + NE(Med) + Med) Anticuerpos Nivel de transcripción a distintos tiempos Reclutamiento de Med y GTFs a distintos tiempos CORRELACIÓN TEMPORAL El reclutamiento del PIC depende de Mediador y determina el nivel basal de transcripción

16 Resultados Templados iG5HML con sitios para activador Gal4 + NE(Med) + Med + Gal4 Anticuerpos Esto se correlaciona con los niveles de transcripción Med parece ser esencial para el aumento de la transcripción en presencia de un activador (los niveles de reclutamiento no parecen diferir por Gal4) Gal4  aumenta reclutamiento de Med y GTFs; si no hay Med, el reclutamiento de GTFs es mucho menor

17 Resultados Templados con TATA + NE(Med) + TFIIB en exceso
Med  el aumento de transcripción se daría por aumento de reclutamiento de TFIIB Un exceso de Med no compensa la falta de TFIIB Control recíproco Control especificidad Un exceso de TFIIF no compensa la falta de Med Un exceso de TFIIB (25x TFIIB endógeno) compensa la falta de Med con respecto a un extracto nuclear no depletado, en cuanto a niveles de transcripción basal

18 Resultados Templados con TATA + NE(IIB) + TFIIB
La transcripción disminuye y sólo vuelve a niveles basales si se suplementa con TFIIB purificado ¿Se debe a disminución del reclutamiento del PIC cuando se elimina TFIIB? Control de la depleción  sólo se eliminó TFIIB y muy pequeñas cantidades de Med u otros GTFs

19 Resultados Templados con TATA + NE(IIB) + TFIIB
TFIIB no es requerido para el reclutamiento de Med, pero sí de Pol II y TFIIE Disminuye reclutamiento de Pol II y de TFIIE en ausencia de TFIIB

20 Resultados Templados con TATA + NE(IIB) + TFIIB
El mismo fenómeno se aprecia a nivel transcripcional; aunque se haya reclutado Med, sin TFIIB hay muy poca transcripción porque no se recluta eficientemente parte del PIC

21 Resultados El nivel de transcripción se ve limitado por el tiempo de reclutamiento del Med cuando es agregado en la incubación

22 Resultados Templados con TATA + Med + TFIID/TBP
El reclutamiento de Med también depende de TFIID, pero no de TBP sola  importancia de TAFs

23 Conclusiones Mediator aumenta la transcripción basal por reclutamiento de TFIIB, TFIIE y Pol II (como mínimo), como se infiere por la correlación temporal de transcripción Mediator-dependiente y reclutamiento Mediator-dependiente El reclutamiento de Mediator es un paso limitante en la formación del PIC y parece depender de la interacción con TFIID (habiendo ésta reconocido a la TATA previamente)

24 Conclusiones Mediator aumenta la síntesis indirectamente al reclutar a TFIIB, que a su vez recluta a Pol II. Es necesario para transcripción basal en extractos nucleares pero no con factores purificados; sin embargo aún no se encontraron cofactores negativos que pudieran explicarlo. Puede deberse a una limitación en los GTFs en los extractos naturales, lo cual concuerda con que TFIIB en exceso puede compensar su ausencia en cuanto a niveles de transcripción basal y reclutamiento de Pol II. También un exceso de TFIIH puede producir este efecto (Nair et al., 2005).

25 Conclusiones Este reclutamiento Med-independiente permite descartar el modelo de holoenzima en que Med cataliza la formación del complejo de Pol y los GTFs que deben unirse juntos a TFIID También implica que aunque los GTFs son irreemplazables por exceso de Mediator, éste podría compensar niveles limitantes de los mismos in vivo, actuando de forma cooperativa. En ausencia de Mediator se necesitaría un nivel muy alto de GTFs.

26 Conclusiones Mediator actúa además de forma directa estimulando la actividad kinasa de TFIIH para la fosforilación de CTD, lo que permite una transcripción eficiente por aumento del reclutamiento y estabilización de factores. La transcripción activada, tanto en extractos nucleares como con factores purificados, es siempre Med-dependiente.

27 Conclusiones Mediator formaría un complejo estable con TFIID, luego de lo cual se reclutaría el resto de los GTFs y la Pol II (no niega que se pudiesen unir en distinto orden, aunque de forma menos eficiente al desaparecer el efecto cooperativo)  stepwise model Este hecho, sumado al factor correspondiente a la interacción entre Mediator y los GTFs, proveería instancias extra para el control de los niveles de transcripción  plasticidad regulatoria

28 Críticas El experimento intenta acercarse a condiciones fisiológicas en cuanto al extracto utilizado; sin embargo el ADN no se encuentra cromatinizado, factor que tiene efectos sobre los niveles de transcripción in vivo. Concluyen que el reclutamiento de Mediator es el paso limitante, pero éste es dependiente de unión de TFIID  la unión de TBP o TAFs podría ser el verdadero paso limitante No analiza función de Mediator en el PIC post-reclutamiento, que pueden haber afectado los niveles de transcripción observados

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