BACTERIOCINAS Marc Antoni Armengol Cubillos 2014 – 2015

Historia Las bacteriocinas fueron descubiertas por André Gratia en 1925, cuando se encontraba investigando métodos para matar bacterias. Gratia llamó a su primer descubrimiento colicina porque actuaba contra E. Coli. El primer antibiótico descubierto fue la penicilina, en 1897 por Ernest Duchesne, en Francia, quien trabajaba con hongos del género Penicillium

Antibióticos y bacteriocinas Un antibiotico es una substancia química de inhibir el crecimiento de otros microorganismos o eliminarlos Una bacteriocina es una toxina proteica sintetizada por una bacteria para inhibir el crecimiento de bacterias similares o pertenecientes a cepas cercanas.

Bacterias del ácido láctico (LAB) Gram positivas Muy heterogéneas desde un punto de vista morfológico y fisiológico No forman esporas Realizan fermentación láctica Aguantan grandes rangos de pH Generan bacteriocinas

Tipos de bacteriocinas en LAB Lantibióticos Bacteriocinas peptídicas Listeria activas Dos péptidos Circulares Bacteriolisinas

Lantibióticos Pequeños Soportan temperaturas elevadas Contienen lantionina Pueden estar compuestas por uno o dos péptidos Gran posibilidad de sufrir modificaciones post-traduccionales Formulación química de la lantinonina

Lantibióticos Lactococcus lactis: Nisina

Bacteriocinas peptídicas Pequeños Soportan temperaturas elevadas No contienen lantionina Subclases: Listeria activas Dos péptidos Circulares

Bacteriocinas peptídicas: Listeria activas Eficaces contra listeria Leuconostoc gelidum: Leucocin A

Bacteriocinas peptídicas: Dos péptidos Eficaces contra Enterococcus y algunos GRAM+ Lactococcus lactis: Lactococcin G

Bacteriocinas peptídicas: Circulares Eficaces contra GRAM+ y - Enterococcus faecalis: AS-48

Bacteriolisinas Grandes No soportan temperaturas elevadas Proteínas líticas Suelen ser hidrolasas de mureína (peptidoglicano)

Bacteriolisinas Enterococcus faecalis: Enterolisina A

Microorganismo productor Bacteriocinas y Microorganismos productores Bacteriocina Clase Microorganismo productor Nisina I Lactococcus lactis subsp lactis Pediocina PA-1 IIa Pediococcus acidilactici y Lactobacillus plantarum WHE92 Pediocina JD Pediococcus acidilactici JD1-23 Sakacina A Lactobacillus sake 706 Sakacina P Lactobacillus sake LTH673 Curvacina A Lactobacillus curvatus LTH1174 Mesentericina Y105 Leuconostoc mesenteroides Plantaricina E/F IIb Lactobacillus plantarum C11 Lactococcina A Lactococcus lactis subsp cremoris Lactococcina B Lactococcus lactis subsp cremoris 9B4 Lactacina F Lactobacillus johnsonii Divergicina IIc Carnobacterium divergens LV13 Helveticina III Lactobacillus helveticus

Producción Directamente en los alimentos Por fermentación in vitro bajo condiciones óptimas Ausencia de factores limitantes (difusión, proteasas y adsorción) Influencia del ambiente (pH, T…)

Purificación Precipitación por SO4(NH4)2, intercambio iónico, interacción hidrofóbica, filtración por gel y cromatografía líquida de alta presión y fase revertida Precipitación por SO4(NH4)2, extracción/precipitación de cloroformo/metanol y cromatografía líquida de alta presión y fase revertida Por una única operación. Ej: “expanded bed adsorption”, usando un gel de interacción hidrofóbica

Purificación Se han obtenido varias entre las que destacan: Amylovorina L (Lactobacillus amylovorus DCE 471). Es de clase II. Algunas enterocinas producidas por Enterococcus faecilum. Lantibiotico Macedocin producido por Streptococcus macedonicus ACA-DC 198.

Aplicaciones Dependen de: Especificidad pH Solubilidad Temperatura

Aplicaciones

Aplicaciones

Regulación sobre su uso Para poder usarse en alimentación deben ser: No tóxicas Estables y muy activas Ampliamente antibacterianas Neutras en aromas y sabores Económicas Fácil uso

Nisina Descrita en 1928, fue la primera bacteriocina aislada a partir de la bacteria ácido láctica Lactococcus lactis subsp lactis. Posee actividad contra Gram positivas, especialmente de los géneros Clostridium, Staphylococcus, Bacillus y Lysteria. Es un péptido de 34 aminoácidos, de bajo peso molecular menor a 5 kDa. La síntesis de la nisina es compleja, requiere de procesos de transcripción, traducción, modificaciones post-traduccionales, secreción, procesamiento, y señales de transducción. acido aminobutírico (Abu) Dehidroxialanina (Dha) Deshidrobutirina (Dhb) Es la única reconocida por la FDA con la categoría GRAS (Generally Recognized As Safe).

DESARROLLO COMERCIAL DE LA NISINA

Ventajas: Sintetizada a lo largo de todo el ciclo celular Evita el desarrollo de clostridios y bacilos Resistencia térmica Estable a pH bajo (<6)

Problemas: Pierde eficacia en alimentos ricos en grasa No compatible con enzimas proteolíticos

Productos preservados con nisina: Queso y preparaciones de queso procesado: 100-250 mg/kg de nisina incrementa la preservación del queso al menos por 6 meses. Leche pasteurizada: 50 mg/kg incrementa la preservación a TA de 2 a 6 días. Leche evaporada enlatada. 80-100 mg/kg previene completamente el crecimiento de bacterias típicas formadoras de esporas permitiendo la reducción del tiempo de proceso por 10 minutos.

Productos preservados con nisina: Alimentos enlatados. 100-150 mg/kg aumenta la vida útil por al menos 2 años y permite procesarlos a menor temperatura. Hongos enlatados. 100-200 mg/kg previene la germinación de esporas después del proceso térmico.

Pediocina Es una bacteriocina peptídica listeria activa producida por Pediococcus acidilactici Se utiliza como conservador en productos vegetales y cárnicos pues tiene un alto potencial para ser utilizado como conservador en alimentos con fermentaciones lácteas.

LAB en probióticos Probiótico “Microorganismo vivo que luego de ser ingerido produce efectos benéficos en el hospedador” (Fuller 1989). Tissier, 1906 Observó, en niños que padecían diarrea, un escaso contenido de bacterias con morfología en Y (bífida) en sus heces, mientras que estas bacterias bífidas eran abundantes en niños sanos).

LAB en probióticos Probiótico “Microorganismo vivo que luego de ser ingerido produce efectos benéficos en el hospedador” (Fuller 1989). Metchnikoff, 1907 Afirmó que la dependencia de los microbios intestinales con respecto a los alimentos hace posible adoptar medidas para modificar la flora de nuestro organismo y sustituir los microbios nocivos por microbios útiles

IgA, immunoglobulina A; TLR, receptor Toll-like. LAB en probióticos Efectos benéficos de los microorganismos probióticos en el tracto gastroinestinal de mamíferos. IgA, immunoglobulina A; TLR, receptor Toll-like. Saulnier et al., 2009

LAB en probióticos Resistencia a la colonización o “efecto de barrera” Aumento en la cantidad de mucinas producidas por las células epiteliales (Caballero-Franco et al., 2009) Exclusión competitiva: colonización de la mucosa intestinal vía adhesinas como las proteínas de capa S Inhibición de la adhesión de patógenos La preincubación de capa S de L. kefir inhibe la invasión de Salomenella (Golowczyc et al., 2007).

LAB en probióticos Efectos sobre el sistema inmune Modulación de la expresión de los receptores Toll-like (Voltan et al., 2007) Transcripción de NF-kB (Matsumoto et al., 2005) Inducción de citoquinas pro y anti inflamatorias (Drakes et al., 2004) Aumento de los niveles de IL-10 (Pessi et al., 2000, Drakes et al., 2004) Inducción de células dendríticas (Christensen et al., 2002)

Futuros campos de uso

Bibliografía Luc De Vuyst-Frédéric Leroy, Bacteriocins from Lactic Acid Bacteria: Production, Purification, and Food Applications, J Mol Microbiol Biotechnol 13, 194-199, (2007) Michael T. Madigan et Al., Brock, Biología de los microorganismos, 12ª ed. (Addison-Wesley, 2009) A.glazer - H. Nikaido, Microbial Biotechnology: Fundamentals of Applied Microbiology, 2ª ed. (Cambridge University Press, 2007) Nicholas C. K. Heng - John R. Tagg, What's in a name? Class distinction for bacteriocins , Nature Reviews Microbiology 4, (Febrero 2006) Katja Siegers et al., Biosynthesis of Lantibiotic Nisin, Posttranslational modification of its prepeptide occurs at a multimeric membrane-associated lanthionine synthetase complex,  The Journal of Biological Chemistry, 271, 12294-12301(24 de mayo, 1996) Protein Data Bank, 2014, http://www.rcsb.org/ Protein model portal, 2014, http://www.proteinmodelportal.org/