MORFOLOGÍA DE LAS COLONIAS BACTERIANAS

Las especies Bacterianas son grupos de cepas con características en común. Sus caracteres fenotípicos se extraen de la morfología (tamaño, aspecto, inclusiones, esporas, capsulas, flagelos, tipos de tinción) sus características en los medios de cultivo (morfología de las colonias, márgenes, elevación, textura opacidad, pigmentación), propiedades bioquímicas, necesidades nutricionales, pruebas serológicas entre otras.

La clave para identificar las bacterias depende del aislamiento en cultivo puro. Las pruebas de identificación se deben hacer en colonias únicas o cultivos puros. Es posible realizar una identificación preliminar o presuntiva de muchas bacterias de importancia clínica en base a pocas características ambientales de su crecimiento óptimo; estudio visual del aspecto colonial y por último su comportamiento metabólico.

Una colonia es una agrupación de bacterias formada a partir de la reproducción de una Unidad Formadora de Colonia (UFC) sobre un medio sólido; aunque varía de tamaño generalmente es visible a simple vista.

Una UFC puede ser un solo microorganismo o bien un grupo de microorganismos de una misma especie como en el caso de bacterias que tienen tendencia a permanecer unidas como los estafilococos o los estreptococos.

Las colonias bacterianas tienen una medida, forma, textura y en algunos casos color característicos, que aunque puede variar de acuerdo al medio en que se encuentren, es constante bajo condiciones controladas y depende de la especie bacteriana que la forme.

Debido a que las características de las colonias ocurren en varios grados y combinaciones dependiendo de las bacterias y son a menudo muy uniformes, sirven para identificar bacterias en cultivos mezclados. Sin embargo, además de éstas características se requiere también estudiar la fisiología y propiedades inmunológicas de las bacterias para poder realizar una identificación completa.

La morfología colonial es comparable a una estadística ya que se deriva de una célula individual pero es la característica de la masa celular. Así pues, por ejemplo, la pigmentación es aparente en la colonia, pero no en la célula individual, en el caso de la consistencia mucosa de algunas colonias esta se deriva de la sustancia capsular en aquellas bacterias con cápsula muy grande.

Medida de las colonias. ésta característica es bastante constante dentro de las especies y puede ir desde colonias muy diminutas hasta un diámetro de varios milímetros. Forma. Está determinada por su borde y su espesor. En la figura 2 se pueden observar varias formas, elevaciones y bordes de colonias bacterianas.

TÉRMINOS DESCRIPTIVOS PARA LA MORFOLOGÍA DE COLONIAS EN LA SUPERFICIE DE UN MEDIO SÓLIDO

Consistencia y textura Consistencia y textura. La consistencia de las colonias puede variar desde una colonia seca que puede moverse sobre el agar con el asa, hasta una colonia viscosa que se pega al asa y forma filamentos o hilos mucosos cuando se trata de separarla del agar.. La superficie puede ser uniformemente brillante y suave o puede ser estriada con muescas concéntricas o quebradas. Al examinar la colonia con luz transmitida puede aparecer con textura granular o amorfa.

Pigmentación. Esta característica es muy común en las bacteria saprófitas en las que las colonias aparecen rojas, anaranjadas, amarillas, etc. De los microorganismos patógenos uno de los pigmentados más importantes es Staphylococcus aureus que tiene un color amarillo dorado. El pigmento no se aprecia en las células individuales a que se debe a gránulos intracelulares muy pequeños para verse con luz transmitida.

SUPERFICIE Lisa Rugosa Plegada   CONSISTENCIA (probarla con el asa) Cremosa Membranosa COLOR Se usan términos comunes para definirlo y se especifica si el pigmento producido difusible o no.

Pseudomonas aeruginosa… Diagnóstico i) Se realiza por los signos y síntomas clínicos ii) P. aeruginosa se identifica por las características de sus colonias (hemolíticas, verdes y con olor a uva)…

CARACTERÍSTICAS ÓPTICAS LUZ TRANSMITIDA (observar a través de la colonia) Opaca: no permite el paso de luz Traslúcida: Deja pasar la luz sin permitir la completa visibilidad de los objetos observados a través de la colonia. Transparente: Deja pasar la luz permitiendo ver claramente los objetos observados a través de la colonia.   LUZ REFLEJADA (observar la superficie de la colonia) Opaca Brillante

CULTIVO EN CALDO Al igual que en los medios sólidos, en los medios líquidos las características de la bacteria sembrada se reflejan en las características que presenta el caldo inoculado como son: Turbidez: Opacidad más o menos densa, signo de crecimiento. Película: Crecimiento casi contínuo sobre el líquido Sedimento: Depósito de células en el fondo del tubo que se resuspende al agitar.

Crecimiento Bacteriano MICROBIOLOGÍA PRACTICA

Crecimiento microbiano Tiene lugar en dos niveles: La célula sintetiza nuevos componentes celulares, e incrementa su tamaño. El numero de células de la población se incrementa.

Crecimiento Bacteriano Aumento de número (no de tamaño) Multiplicación bacteriana: fisión simple o binaria Elongación Auto duplicación de ADN cromosómico Tabicado central Invaginación membrana celular Síntesis de pared

Efecto de la concentración de sustrato en el crecimiento máximo de microorganismos. Conforme la concentración de sustrato se incrementa, también lo hace la producción máxima de microorganismos.

Fisión binaria de una bacteria en forma de bacilo a) Célula joven b)La célula madre alarga su pared y membrana celular. Se empieza a formar un septum y el cromosoma se duplica. c)Los cromosomas duplicados se colocan en lados opuestos de la célula. d)El septum es sintetizado completamente y la membrana celular se separa en dos células distintas. e) Las células hijas se dividen.

Matemáticas del crecimiento de una población a)Empezando con una célula, si cada producto de la reproducción se divide por fisión binaria, la población se doblara con cada nueva generación. Este proceso puede ser representado con logaritmos (2 elevado a un exponente). b)Al dibujar el log de las células se produce una línea que indica el crecimiento exponencial: si se dibuja el numero de células aritméticamente, se obtiene una línea curva.

Curva de Crecimiento Bacteriano Bacteria en medio adecuado Gráfico de coordenadas: número de bacterias (logaritmo) versus lapso de tiempo. Distinta para cada bacteria En todas se identifican cuatro etapas

Fase de Latencia El número de microorganismos no varía Adaptación al medio, producción de enzimas Tiempo variable: entre una hora a días. Tamaño relativo aumentado por división

Fase exponencial o de crecimiento logarítmico Relación casi lineal entre el tiempo y el número de elementos. Actividad metabólica incrementada Depende del tiempo de generación de cada bacteria Los antimicrobianos son mas activos Puede haber variaciones entre el crecimiento in vitro e in vivo.

Fase Estacionaria En determinado punto el crecimiento disminuye La población no aumenta Células nuevas reemplazan a las células muertas Actividad metabólica mas lenta Células en animación suspendida Producción de metabolitos secundarios Antibioticos Toxinas Fase de Esporogenesis para las especies productoras de esporas

Fase de declinación o muerte Recuento de células disminuye sensiblemente El numero de células muertas supera al número de células vivas Acumulación de productos tóxicos Disminución de nutrientes Aparición rápida : autolimitar diseminación infecciones

Curva de crecimiento bifásica

RECUENTO BACTERIANO

CONTEO DE CÉLULAS VIABLES ALIMENTO CAJA PETRI MICROSCOPIO La célula viable es aquella capaz de dividirse y formar una colonia en el medio de cultivo. Se basa en que cada colonia surge de una simple célula. Cada colonia contiene una sola especie bacteriana.

RECUENTO BACTERIANO

CONTEO DE CÉLULAS VIABLES El número de bacterias viables por muestra se expresa en: UNIDADES FORMADORAS DE COLONIAS (UFC) Representa cada colonia contada y su número total representa el número total de bacterias viables en la muestra.

DETERMINACIÓN No. UFC Método de vertido en placa Método de extensión

CONTEO DE CÉLULAS VIABLES MÉTODO DE EXTENDIDO EN PLACA Es el método de elección para anaerobios facultativos y cultivo de microaerófilos.

CONTEO DE CÉLULAS VIABLES MÉTODO DE VERTIDO EN PLACA. Esta técnica se usa generalmente para bacterias aerobias obligatorias.

CONTEO DE CÉLULAS VIABLES Útil para la técnica de vertido en placa o extensión en placa. Se siembran volúmenes conocidos de cada dilución Luego se incuba a 35 – 37 0C durante 24 – 48 horas.

TÉCNICAS DE RECUENTO Finalizado el tiempo de incubación, se realiza el recuento. Se toman en cuenta únicamente aquellas cajas Petri que tengan entre 30 y 300 colonias. Este número de colonias es estadísticamente representativo. Aquellas placas que tengan más de 300 colonias se reportan como “INCONTABLES”.

TÉCNICAS DE RECUENTO Para el recuento bacteriano se puede usar cuentacolonias.

RECUENTO CON CUENTACOLONIAS Puede ser contada toda la placa o por cuadrantes. Cuando la carga bacteriana es alta, se toma en cuenta un cuadrante con carga alta, un cuadrante con carga media y un cuadrante con carga baja. Se realiza la sumatoria de los tres cuadrantes y se saca el promedio. Finalmente el promedio se multiplica por 65 No. Colonias = (CA + CM + CB /3) * 65

CA = 32 CM = 19 CB = 10 Sumatoria Σ = 61 Promedio 61/3 = 20.33 Factor = 20.33*65 = 1322

OBTENCIÓN DE RESULTADOS Terminado el conteo por cualquier método, se debe aplicar la siguiente fórmula para obtener el No. de UFC/ ml o UFC/g. UFC/ml ó UFC/g = No. de colonias por placa X el factor de dilución * ml de la muestra sembrada *Factor de dilución: inversa de la dilución.

EJEMPLOS EJEMPLO 2 EJEMPLO 1 No. de colonias: 56 No. de colonias: 280 Dilución: 10 -4 Volumen de siembra: 0.2 ml UFC/ ml = 56 X 10000 /0.2 UFC/ ml= 2 800.000 EJEMPLO 1 No. de colonias: 280 Dilución: 10 -3 Volumen de siembra: 1 ml UFC/ ml = 280 X 1000 /1 UFC/ ml= 280.000

UFC / ml parámetro = UFC / ml dilución A + UFC / ml dilución B Cuando se realiza más de una dilución para cada uno de los parámetros se garantiza los resultados obtenidos. Este método disminuye el margen de error y valida la calidad de las pruebas. Para obtener los resultados por duplicado se aplica la siguiente fórmula: UFC / ml parámetro = UFC / ml dilución A + UFC / ml dilución B 2

EJEMPLOS Ejemplo 1 Dilución A: 5 600.0000 Dilución B: 6 000.000 Resultado : 5 600.000 + 6 000.000 / 2 = 5 800.000 UFC / ml FLORA TOTAL Ejemplo 2 Dilución A: 1 245.647 Dilución B: 2 340.500 Resultado: 1 245.647 + 2 340.500 / 2 = 1 793.074 UFC / ml FLORA COLIFORME

Otros métodos Directos Filtración Método del número más probable Recuento microscópico directo

Métodos indirectos Turbidimetría Actividad metabólica Peso seco