Análisis molecular de la mutación del EGFR en el CPCNP: perspectiva del patólogo en el laboratorio de biología molecular Dra. Edith Illescas Patóloga y Directora del Laboratorio Oncogen S.R.L. Buenos Aires, Argentina

¿Cuándo debe analizarse el EGFR en el CPCNP? Selección de pacientes para terapias TKI[a] No deben ser excluidos pacientes basándonos en características clínicas:[b] Etnia Sexo Edad Historia del hábito de fumar CPNCP = cáncer de pulmón de células no pequeñas TKI = inhibidor de la tirosina quinasa a. Rosell R, et al. Lancet Oncol. 2012;13:239-246. b. Zorrilla AF, et al. J Clin Oncol. 2012;30(Suppl):Abstract e18114.

¿Qué carcinomas deben analizarse? Recomendaciones del Colegio Americano de Patólogos y aplicación en Latinoamérica Para carcinomas Tipo histológico adenocarcinoma y carcinomas mixtos con componente de adenocarcinoma, sin tener en cuenta el grado histológico No se recomienda en carcinomas de: Células escamosas puras Células pequeñas puras Células grandes sin parámetros por inmunohistoquímica de evidencia de diferenciación adenocarcinomatosa College of American Pathologists http://www.cap.org/apps/cap.portal

¿Qué carcinomas deben analizarse? (cont.) Recomendaciones del Colegio Americano de Patólogos y aplicación en Latinoamérica Se recomienda en los carcinomas realizar la determinación molecular independientemente del tipo histológico: En muestras pequeñas (punción aguja fina – citológicos) Cuando el componente adenocarcinomatoso no puede ser confirmado ni excluido En tumores de tipo indiferenciados Muestras de metástasis óseas que han sido descalcificadas o pretratadas con ácidos deben solo utilizarse para el análisis en caso de ser el único material biológico College of American Pathologists http://www.cap.org/apps/cap.portal

¿Cuándo debe analizarse el paciente? En el momento del diagnóstico, de la recurrencia o de la progresión En pacientes en tratamiento de 1ª y/o 2ª línea En tumores primarios – recurrencia y/o metástasis En carcinomas en estadio avanzado (IV) En estadios I, II y III, se tomará la decisión en colaboración interdisciplinaria con los médicos que lo están tratando College of American Pathologists http://www.cap.org/apps/cap.portal

¿En qué tiempo deberá estar disponible el resultado? En 5 a 7 días hábiles - comienzo del tratamiento en el momento adecuado Dentro de las 48 h siguientes de la recepción de la muestra en el laboratorio, deberá confirmarse bajo control microscópico la viabilidad del análisis por metodología molecular College of American Pathologists http://www.cap.org/apps/cap.portal

¿Qué muestras pueden estudiarse? TODAS Taco de parafina de resección quirúrgica Biopsia por punción Citológico Impronta Extendido Material fresco Material fijado en alcohol Hay que tener en cuenta que los requerimientos para inmunohistoquímicas y FISH (conservación proteica) no son necesarios para técnicas de ADN College of American Pathologists http://www.cap.org/apps/cap.portal

¿Qué requerimientos son necesarios? Viabilidad de la muestra Microscopia óptica Presencia de células tumorales Calidad de células tumorales Cantidad de células tumorales (10%) Proporción de células tumorales Selección de sectores tumorales bajo control microscópico de una tinción hematoxilina-eosina en la disección del corte en blanco, evitando tejido wild- type, si es posible College of American Pathologists http://www.cap.org/apps/cap.portal

Envío incorrecto de la muestra Múltiples cortes de parafina Biopsia por punción Hay tumor??? Múltiples cortes de parafina Tumor quirúrgico Hay tumor ??? Imagen cortesía del Laboratorio Oncogen S.R.L.

Microdisección Corte en blanco Imagen cortesía del Laboratorio Oncogen S.R.L.

¿Qué metodologías de detección deben utilizarse? Metodologías que detecten un mínimo del 10% de células tumorales y el 99,9% de las alteraciones génicas posibles Sistema de PCR de los exones 18, 19, 20 y 21 Sistema nested o heminested (recomendable en material parafinado) Recomendación técnicas por PCR nested y secuenciación automática College of American Pathologists http://www.cap.org/apps/cap.portal

¿Cómo debe entregarse el resultado? Con la alteración génica encontrada, indicar la inserción, mutación, deleción, el codón y el aminoácido Incluir la interpretación adecuada concreta y completa del tipo de alteración y su implicancia en el tratamiento con TKI Alteración clásica o no clásica Entrega de los informes de secuenciación bidireccionales con el primer FW y RV de cada exón descartando falsos positivos o secuencias artificiales por degradación del ADN o mal procesamiento preanalítico College of American Pathologists http://www.cap.org/apps/cap.portal

Ejemplo del exón 19 acgtcttccttctctctctgtcatag G 729 gga L 730 ctc W 731 tgg I 732 att P 733 cca E 734 gaa G 735 ggt E 736 gag K 737 aaa V 738 gtt K 739 aaa I 740 att P 741 ccc V 742 gtc A 743 gct I 744 atc K 745 aag E 746 gaa L 747 tta R 748 aga E 749 gaa A 750 gca T 751 aca S 752 tct P 753 ccg K 754 aaa A 755 gcc N 756 aac K 757 aag E 758 gaa I 759 atc L 760 ctc D 761 gat 762 gtg 763 agt 764 ttc 765 tgc tttgctgtgtgggggtccatggctctgaacctcaggcccaccttttct Laboratorio Oncogen S.R.L.

Exón 20 EGFR - R803W – CGG-TGG Arginina-triptófano T Arginina-triptofano CGG-TGG Imagen cortesía del Laboratorio Oncogen S.R.L.

La mutación como paradigma en el análisis del EGFR en el CPCNP Es estudiar a todo paciente sin excluirlos basándose en características clínicas como: Etnia Sexo Edad Historia del hábito de fumar Zorrilla AF, et al. J Clin Oncol. 2012;30(Suppl):Abstract e18114.

Gracias por su participación en esta actividad.