Extracción de Ácidos Nucleicos: DNA Cromosomal y Plasmido Laboratorio de Genética JACardé, PhD UPR - Aguadilla

Objetivos Al completar la discusión de esta presentación los estudiantes podrán: Establecer los propósitos para la extracción de DNA cromosomal y/o de plásmidos Comparar DNA cromosomal y de plásmidos Mencionar los pasos necesarios para la extracción de ácidos nucleicos Discutir la importancia de cada reactivo utilizado en el proceso Realizar una extracción de DNA cromosomal o de plásmido de bacterias E. coli.

Introducción Los acidos nucleicos con los que se trabaja en laboratorios de investigación son DNA y RNA El DNA es una molécula enorme y contiene la información genetica para dirigir las actividades celulares Aislado por primera vez por Friedrich Meischer en 1869 Nucleina: sustancia acida, aislada de nucleos de celulas blancas en vendajes de heridas

Introducción Levene: Molécula de DNA formada por tres componentes principales Pentosa Deoxiribosa Ribosa Grupo fosfato Base Nitrogenada Purina: GA Pirimidinas : CUT Es un polímero de unidades individuales, monómeros o nucleótidos Chargaf: proporciones iguales de purinas y pirimidinas pero no de los cuatro nucleótidos Franklin: difracción de rayos X sugirió la estructura helicoidal de la molécula de DNA

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Nucleotidos

Introducción Watson y Crick: modelo de la estructura Es de doble hebra de nucleótidos en espiral formando doble hélice Espinazo de azucar y fosfato en el exterior Combinaciones de las 4 bases en pareja unidas por enlaces de H en el interior (A=T o C=G) complementaridad Conservado: presente en procariotes y eucariotes Procariotas: Doble hebra circular, no núcleo, cromosomal Plásmidos: doble hebra circular pequeño, extracromosomal Libre sin proteínas asociadas Eucariotas: en el núcleo, en la mitocondria/cloroplasto Doble hebra lineal en el núcleo o como procariotas en mito y cloro Unido a proteínas básicas; eucariotas

Aislamiento de DNA: Procedimiento común en múltiples áreas: genética de bacterias, biología molecular, bioquímica Para obtener DNA relativamente puro en suficiente cantidad para otras aplicaciones. Una vez purificado se usa en múltiples aplicaciones Estudiar su estructura Interacciones con proteínas Hibridaciones Secuenciación PCR Enzimas de restricción Análisis por electroforesis

Configuraciones del DNA El DNA en bacterias puede tener dos configuraciones: cromosomal y plásmido Cromosomal: grande (4.6mb), circular, frágil Denatura y renatura dificil se rompe mas facil Lisis alcalina

Plásmidos Extracromosomal Pequeños (2-10 kb) Estables, facil de denaturar y renaturar Características específicas Ori Amp Polylinker (MCS)

Aislamiento de DNA: En general: Lísis celular y solubilización del DNA Remoción de contaminantes Pasos generales para toda extracción: 1. Homogenizar o desorganizar el tejido o las células Lísis celular para liberar el DNA: hipotónica, enzimática, mecánica 2. Inhibición de DNAsas Preservar la estabilidad: temperatura, quelantes, guantes 3. Disociación del complejo de nucleoproteínas SDS, fenol, proteinasa K, alcalinidad y sales 4. Remoción de contaminantes Fenol/cloroformo, alcoholes, salting out, RNAsa 5. Precipitación y concentración del DNA Alcohol, frío, sales, RN Romper, solubilizar y purificar Romper, denaturar alcalino, renaturar, purificar

Overview of DNA Extraction Break down the cell wall and membranes Centrifuge to separate the solids from the dissolved DNA Precipitate the DNA using isopropanol Centrifuge to separate the DNA from the dissolved salts and sugars Flowchart of the various steps Dissolve DNA Wash the DNA pellet with Ethanol and dry the pellet Analyze: Agarose Gel Electrophoresis

Materiales Cultivo de E coli, 12-16 hrs (late log phase) Medio cultivo (Ej:luria broth) Buffer GTE (Glucosa, 50mM, Tris 50mM, EDTA 10 mm) NaCl 10 mM SDS 10%, pH 7.2 Erlenmeyer de 100 ml Platos petri Pipetas, puntas y microtubos Orbital Shaker Metro de pH Balanzas Centrifugas

Procedimiento: Extracción DNA Genómico Tomar 1.5-3ml de un cultivo de bacterias de 12-16 hrs de crecimiento Centrifugar a 10,000rpm por 5 min, obtendrá un precipitado de células. Descartar el sobrenadante decantando y añada 200 ul de buffer GTE para lisar las células, resuspender con vortex. Dejar reposar a RT opr 5 minutos. Añadir 400 µl de SDS 1% e incubar en hielo por 5 minutos.

Procedimiento: Extracción DNA Genómico 6. Añadir 60 µl de NaCL 10mM y 700 µl de isopropanol. Mezclar invirtiendo suavemente 7-10 veces. Centrifugar a 10,000rpm por 20 min. Decantar el sobrenadante, escurrir el tubo sobre un papel absorbente y dejar reposar al aire por 5-10 min para evaporar el alcohol. Resuspender y disuelver en 50µl de buffer TE, y transferir la solución a un tubo nuevo. Analizar por electroforesis.

Procedimiento: Extracción DNA Extracromosomal, Método de Alcalino Materiales: Medio de cultivo LB Buffer P1: (50mM glucosa, 10mM EDTA, 25 mM Tris, ph8.0, a 4C) Buffer P2: (0.2NaOH, 1%SDS, RT) Buffer P3: (3M KOAc,ph 6.0, (60ml Kac 5M, 11.5ml de acetato glacial y 28.5 ml de Agua, RT)) Buffer TE: (1mM EDTA, 10mM Tris-HCl, pH 8.0) 6. RNAasa 7. Isopropanol 8. Etanol

Procedimiento: Extracción DNA Extracromosomal, Alcalino Incubar 3-5ml de E coli en LB con el antibiótico necesario por 12-16hras con agitación a 37C. Transferir 1.5ml del cultivo a un tubo de 1.5ml y centrifugar por 1 min para recoger las células. Descartar el sobrenadante decantando, e invertir sobre un papel absorbente por 1 minuto. Añadir 100µl de Buffer de resuspensión P1 y aplicar vortex. Añadir 100 µl de Buffer de lisis P2 y mezclar suavemente invirtiendo 5-7 veces, la solución se tornará clara y viscosa por la lísis. Añadir 150 µl de P3 para neutralizar y mezclar invirtiendo 10-15 veces. El precipitado blanco es el cromosoma. Centrifugar a 12000rpm por 10 min.

Procedimiento: Extracción DNA Extracromosomal, Alcalino 8. Cuidadosamente transferir el sobrenadante a un tuvo limpio asegurándose de no tocar ni remover el precipitado blanco. 9. Añadir 2.5-5 veces el volumen de etanol frío y mezcle invirtiendo. 10. Incubar el tubo por 30 minutos o mas a -20C 11. Centrifugar a 12,000 rpm a 4C por 10 min 12. Descartar el sobrenadante y escurra el tubo sobre papel absorbente 13. Incubar a RT por 10-20 minutos para secar o a 37C. El precipitado se verá blanco/transparente. Resuspender el DNA en 50µl de buffer TE. Disolver pipeteando varias veces. Añadir RNAasa para una concentración final de 1mg/ml. Cuantificar y analizar por agarosa.

Informe de lab A computadora, uno por grupo. Como para que otra persona los use para repetirlos. Introducción: Sobre el DNA y la importancia de extraerlo. Pregunta de investigación, objetivo e hipótesis. Procedimiento paso por paso, (flow chart) Observaciones, diagramas, dibujos, ilustraciones Resultados Que salió Láminas, fotos, dibujos. Discusión Repasar los resultados y hablar de porque salió lo que salió, porque no. Funcionaron los reactivos. Referencias, APA

Referencias 3. http://bitesizebio.com/1660/plasmid-v-genomic-dna-extractionthe-difference/ 4. http://learn.genetics.utah.edu/content/labs/extraction/howto/ 5. http://serc.carleton.edu/microbelife/research_methods/genomics/dnaext.html