TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO MOLECULAR Dra. Mariana L. Ferramola Curso de Técnicas moleculares aplicadas a bioquímica clínica. Área de Qca. Biológica FQByF, UNSL 2014

REACCIÓN DE PCR Esta reacción permite obtener un gran número de copias de una secuencia de ácido nucleico determinada, ya sea ADN o ARN.

RT-PCR Muestra de partida: ARN. Pasos de reacción: Transcripción reversa para obtención de ADNc. Amplificación de la secuencia deseada mediante PCR.

RT-PCR: Detección de virus de Influenza A. Pachucki y col., JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, June 2004, p. 2796–2798. Muestra: Hisopado nasal y faríngeo. Transcripción Reversa: RNA total, usando random primer hexamers. Identificación del virus de Influenza A mediante amplificación por PCR del gen de matriz de dicho virus (212bp). En esta Reacción de PCR los negativos corresponden a las muestras sin retrotranscribir. La banda de 300pb corresponde a la b2-microglobulina humana, esada como control interno, mientras que la banda de 212 pb corresponde al gen de la matriz del virus de influenza A.

RFLP-PCR Esta técnica aprovecha la aparición o eliminación de un sitio de corte para una enzima de restricción, debido a una mutación puntual. La técnica consta de dos pasos sucesivos: Amplificación de la secuencia de interés mediante PCR. Restricción de la secuencia amplificada con una enzima específica.

RFLP-PCR: Acción de las enzimas de restricción.

RFLP-PCR

RFLP-PCR: Detección de alelo Duarte (mutación N314D). La variante Duarte, es un alelo polimorfico del gen GALT, que da como resultado que la enzima presente actividad disminuída. La variante se debe a la mutación N314D, en la cual hay una sustitución (c.940A˃G), que genera un cambio del aminoácido asparagina (Asn, N) por un ácido aspártico (Asp, D). Este polimorfismo genera un cambio de bases que determina un sitio de corte para la enzima de restricción AvaII.

RFLP-PCR: Detección de alelo Duarte (mutación N314D).

RFLP-PCR: Detección de alelo Duarte (mutación N314D). Análisis de la mutación N314D en el exón 10 del gen GALT humano. Línea 4: homocigota para el alelo mutado; líneas 1, 2, 5 y 6: heterocigotas y líneas 3 y 7 al 10: homocigotas para el alelo normal

RFLP-PCR: Detección de virus de Influenza A resistentes a Amantadina. Pachucki y col., JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, June 2004, p. 2796–2798. Primeramente se realiza una amplificación del gen de la proteína M2. Luego se detectan mutaciones puntuales que dan resistencia a amantadina, mediante el uso de enzimas de restricción. El segmento amplificado tiene 164 pb. El alelo mutado en posición 30 que confiere resistencia da lugar a la pérdida del sitio de restricción para la enzima ItaI. No se encontraron mutaciones en posición 30 en estos pacientes. El alelo mutado en posición 31 genera un sitio de corte para la enzima SspI. Se encontró esta mutación en los pacientes 2, 3, 4.

Se utiliza para detectar delecciones en el ADN. GAP-PCR. Se utiliza para detectar delecciones en el ADN. Puede usarse un único par de primers que flanqueen la zona deleccionada, de modo tal que esta sea amplificada en la reacción de PCR. Para delecciones pequeñas (menores de 1Kb) el par de primers utilizados generará dos productos de amplificación, el fragmento de menor tamaño se producirá a partir del alelo que presenta la delección. Cuando la delección es mayor, la distancia entre los primers en el alelo normal es demasiado grande como para ser amplificada, y sólo se obtendrá producto a partir del alelo que presenta la delección (alelo mutado). En estos casos, el alelo normal es detectado usando un tercer primer, cuya zona de hibridación se encuentre dentro de la región que se encuentra delecionada en el alelo mutado

GAP-PCR: Detección de delecciones que causan α-talasemia.. Alelo normal Alelo mutado

Long range PCR. Esta técnica ha sido utilizada para detectar delecciones e inserciones. Pueden obtenerse amplicones de hasta 30Kb. El protocolo de PCR es modificado por la introducción de una polimerasa con actividad correctora de pruebas (3’-5’-exonucleasa) además de la Taq polimerasa.

Long range PCR: Detección de inserciones

SSCP (Polimorfismos de conformación de cadena única).. La técnica de SSCP detecta variaciones en la secuencia del ADN (mutaciones puntuales y otros cambios pequeños) debido a la generación de diferencias en la movilidad electroforética. Bajo condiciones no desnaturalizantes, las moléculas de ssADN asumen conformaciones únicas que dependen de su secuencia de nucleótidos. Los cambios conformacionales producidos por variaciones en la secuencia de ADN pueden resultar en diferencia de movilidad detectables. La mayoría de los experimentos de SSCP son diseñados para evaluar polimorfismos en un único locus, y comparar los resultados entre individuos diferentes.

SSCP Un par de primers específicos es utilizado para amplificar el ADN blanco. La muestra se enriquece en ssADN por medio de una PCR asimétrica, debido a la presencia de uno de los primers en mayor cantidad que el otro. Las movilidades de los fragmentos simple cadena se comparan mediante electroforesis en un gel neutro de poliacrilamida. Las bandas son detectadas.

SSCP: esquema de trabajo.

SSCP: ejemplo. El análisis del ADN por SSCP muestra haplotipos múltiples , o sets de alelos usualmente heredados como una unidad. Las calles 3 y 4 mostraron haplotipos idénticos de dos individuos diferentes. Las diferencias de migración de bandas en calles adyacentes está asociada con la cantidad de nucleótidos diferentes presentes: calles 2-3 (2); calles 3-4 (0); calles 4-5 (3); calles 5-6 (1); calles 6-7 (3); calles 7-8 (1); calles 8-9 (1); y calles 9-10 (4).

Transferencia Southern Se utiliza para analizar fragmentos de DNA generados por digestión con enzimas de restricción.

Transferencia Southern

Transferencia Southern Se utilizan sondas de gran tamaño, con grados de actividad variable, dependiendo del uso. Detección de secuencias relacionadas ( ej. familias de genes). Detección de deleciones e inserciones grandes causantes de enfermedades (ej. Distrofia muscular de Duchenne). Identificación de individuos mediante VNTR. Detección de RFLP. Principales usos: