Gene editing Sistema CRISPR – Cas9 gracias Ariel Waisman !

CRISPR – Cas9 Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats Sistema de defensa de procariotas contra el ataque de virus Función: destruir el genoma - ADN / ARN - viral Existen 11 sistemas distintos dependiendo de Qué organismo provienen Tipo de proteína nucleasa Cas Target: RNA o DNA

CRISPR – Cas9 Science 2012 NUCLEASA (Cas) RNA GUÍA

CRISPR – Cas9 Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats en bacterias En realidad son repeats de 28 nucleotidos que contienen secuencias internas de 5 nt palindrómicas. Entre los repeats, se supone que los virus insertaron parte de su genoma (protospacers) en el genoma bacteriano → spacers Regiones Spacer bacterianas (derivadas de fagos) Regiones Protospacer virales embebidas en algunos spacers, hay genes de endoDNAsas (Cas) y endoRNAsas (Cys) spacers Cys variado repertorio de inmunidad contra fagos guideRNAs

CRISPR – Cas9 Destrucción del genoma viral Double Strand Break!! RNAsa Cys4 Destrucción del genoma viral cas Double Strand Break!!

Organización genómica del “locus” CRISPR en bacterias, vecino al operón Cas9 (endoDNAsa) codifica a endonucleasa (DNAsa) transactivating crRNA (scaffold, de andamiaje a Cas9) es clivado por RNAsas Cys

CRISPR repeat CRISPR repeat Purificación de Cys4 acción in vitro embebidos en algunos spacers, hay genes de endoDNAsas (Cas) y endoRNAsas (Cys) Purificación de Cys4 acción in vitro de Cys4

maduración del pre-crRNA por endoRNAsas y asociación del tracRNA (estructural) efectores del DSB en DNA target invasor

bueno….trasladando CRISPR a eucariotas… componentes Cas9 + sgRNA ¿Cómo nos podría servir este sistema de inmunidad natural de bacterias a fagos para hacer Gene editing? Gene editing Capacidad de eliminar, reemplazar, modificar secuencias de un genoma en forma altamente específica No al azar! bueno….trasladando CRISPR a eucariotas… componentes Cas9 + sgRNA creando un sistema que genera DSB en una secuencia determinada

¿Puedo “targetear” cualquier secuencia de un genoma? SI La endonucleasa Cas9 5′-NGG no tiene repeats CRISPR Single guide RNA (sg RNA) Secuencia guia Secuencia CRISPR y“scaffold” (tracrRNA) artificialmente fusionadas entre sí y además a la guía específica a elección del investigador Requerimiento: la secuencia target tiene que estar seguida inmediatamente río abajo por una secuencia PAM: 5′-GG por la que Cas9 tiene afinidad

CRISPR – Cas9 esquema muy simplificado target DSB scaffold target Sec guía propiamente dicha DSB CAs9 rompe ambas hebras (es un DSB)

Una vez generado el DSB en el genoma… Dos formas de “reparación” por la célula: Genera INDEL mutations Cambio marco de lectura o aparición de STOP prematuro Non homologous end joining (NHEJ) Knock-out del alelo Homologous Recombination (HR) Si además agregamos un vector “de reparación” con secuencias homólogas flanqueando la modificación que se quiere hacer… Knock-in del alelo

¿Cómo hacemos que se exprese la Cas9 y el sgRNA? Vector básico: O variantes…

Pero… Off-targets! …todo es color de rosas? ¿Algo puede malir sal? ¿Cuán específico es? Cuidado con los Off-targets! Lo bueno: Software permite predecirlos en base a su secuencia y verificarlos

Entonces… Queremos generar una línea celular con un alelo de un gen knockeado… Diseñar secuencia guía teniendo en cuenta PAM (5’ – NGG) Se hace con la ayuda de un software Clonar secuencia guía elegida en el vector sgRNA/Cas9 Transfectar células con el vector En células transfectadas se expresa Cas9 y sgRNA. Con ata eficiencia, ocurre el DSB en uno o en ambos Alelos. Si deseamos knock-in, también agregar vector con la otra versión del gen Seleccionar células transfectadas (Puromicina, si usamos vector comercial pspCas9) Validar el editing (mediante PCR y secuenciación) Validar no haber generado OFF-targets PCR para genes homólogos y y secuenciación

Knock-out para animales modelo de enfermedades humanas un ejemplo: 2013 directamente inyectan RNA de Cas9 y sgRNA en cigotos !! evitan quimeras Modifican 5 genes distintos en un solo paso!!! Con uno de esos genes (Tet3), consiguieron: de 8 blastocistos obtenidos: 3 homocig, 3 heterocig y 2 fallaron

¿También sirve para hacer transgénicos? Claro! Y de manera sitio-dirigida Por ejemplo, en ratones, igual que para KO: Una forma Modificar células madre embrionarias Inyectarlas en blastocistos Transferir a madre adoptiva y obtener animales quimera Otra forma Directamente en cigoto y transferir blastocisto resultante a madre adoptiva: crías genéticamente homogéneas, es decir no-quimeras

Y la construcción? Se agrega un vector (de “reparación”) con secuencias homólogas al sitio target (“brazos” ) flanqueando la inserción que se quiere introducir ejemplo: tagging de proteínas endógenas; evita introducir proteína taggeada exógena + el reemplazo ocurre mediante HR

¿Y terapia génica…? es un knock-in (2014) 32: 551–553. Ratones modelo con una mutación puntual en el gen Fah daño hepático severo Pero si les inyectan en la cola sgRNA + Cas9 + secuencia WT es un knock-in ssDNA de 180 b!! Con “bracitos” de homología reparación de la mutación

Otro ejemplo: Terapia anti-HIV Yin et al. MOLECULAR THERAPY. 3 May 2017, Pages 1168-1186 In Vivo Excision of HIV-1 Provirus by saCas9 and Multiplex Single-Guide RNAs in Animal Models si se dirige corte en dos sitios cercanos → deleción

Ventajas del sistema CRISPR Sólo hay que diseñar un sgRNA y no una proteína! Es mucho más barato, más rápido y más fácil Más eficiente que otros sistemas (Zinc finger nucleases y TALEN) Se pueden hacer múltiples modificaciones en el genoma al mismo tiempo. Individuos (plantas o animales) con varios genes mutados al mismo tiempo Grandes deleciones eligiondo 2 sitios target cercanos

Ademas… Se diseñaron variantes la proteína Cas9 nCas9: Proteína “nickasa” (le falta un dominio). En vez de generar DSBs, genera nicks en una cadena. Reduce la frecuencia de NHEJ y favorece HR para knock-in Cas9 sin actividad endonucleasa: se dirige al sitio elegido (mediante sgRNA), pero no lo corta: Se la puede fusionar a GFP y mostrar la ubicación aproximada de un locus en su cromosoma en células vivas.

Desventajas y peligros Su rápida evolución deja poco tiempo al análisis ético y de bioseguridad Organismos editados por CRISPR podrían perturbar ecosistemas Se han modificado embriones humanos con CRISPR en el laboratorio. Creación de virus que distribuyen CRISPR para generar modelos de cáncer de pulmón El peligro de los Off-target en el uso biomédico Conclusión… CRISPR-Cas9 arrancó con todo! Se pudo “editar” el genoma de líneas celulares humanas, ratones, zebra fish, plantas, drosophila, C. elegans, levaduras y bacterias. Y esto recién empieza!