Dr. Rafael Valdés González-Salas Xenotrasplante de islotes porcinos y células de Sertoli en pacientes diabéticos tipo 1. Dr. Rafael Valdés González-Salas Laboratorio de Xenotrasplantes, Hospital Infantil de México Federico Gómez, México, D.F. MEXICO.

Antecedentes

Antecedentes Diabetes en México. Evolución del tratamiento convencional. Evolución del esquema intensivo Trasplante de islotes (alogénico). Trasplante de islotes (xenogénico).

Justificación Aún con el esquema intensivo las complicaciones aparecerán. En transplantes alogénicos: Escasez de donadores cadavéricos. Mayor riesgo de transmisión de enfermedades. Complicaciones quirúrgicas Daño hepático Alto costo del tratamiento inmunosupresor Alto riesgo de complicaciones secundarias Tiempo de sobrevida corto

Xenotrasplante Riesgo de infección por Retrovirus Endógeno Porcino (PERV) Otras zoonosis

Retos del Xenotrasplante Supervivencia de las células implantadas: Rechazo inmunológico Factores no inmunológicos Compatibilidad funcional de las células implantadas De la insulina porcina y otras hormonas De los sistemas reguladores humanos

Diseño Experimental Creación de un sitio inmunológicamente privilegiado: Dispositivo Formación de colágena autóloga Inmunomodulación por células de Sertoli Trasplante Islotes + Sertoli

Dispositivo Usamos un dispositivo diseñado en nuestro laboratorio, que consiste en un cilindro de malla metálica de 6 cm de largo, con dos tapones de polipropileno, uno de ellos con un émbolo que llena el cilindro.

Implante del dispositivo Dos meses antes del xenotrasplante, dos a cuatro dispositivos fueron implantados subcutáneamente en la pared abdominal anterior.

Procesamiento de Islotes y Sertolis El páncreas es removido inmediatamente después de eutanasia por exanguinación. Se utilizan cerdos de 7 días de vida El páncreas y los testículos son macerados y digeridos con una solución de Liberasa HI. Los islotes y las Sertolis son cultivados separadamente a 37°C

Control de calidad La viabilidad es determinada por tinción de ioduro de propidio (Islotes:94%, Sertoli 95%) La pureza de los islotes es de 88% Con tinción de Ditizona. Funcionalidad: Índices de estimulación de Islotes =11.5 Sertoli: detección de Closterinas Pureza de Sertoli 93.6%: por MIS y sox9. Apoptosis (Islotes: 4.8%, Sertoli 10.5%) Cytometría de flujo contra Annexina

Diseño Experimental 12 adolescentes con Diabetes Tipo 1 Consentimiento Informado: Reclutamiento totalmente voluntario Pronóstico con tratamientos actuales Procedimiento Experimental Objetivos Metas Riesgos Costo económico Obligaciones del voluntario Obligaciones del Hospital

Bioética Instituciones revisoras: Comisión Nacional de Bioética Facultad de Medicina, UNAM Hospital Infantil de México Federico Gómez

Bioética Cumplimiento de la declaración de Helsinki “Art. 32. Cuando los métodos preventivos, diagnósticos o terapéuticos disponibles han resultado ineficaces en la atención de un enfermo, el médico, con el consentimiento informado del paciente, puede permitirse usar procedimientos preventivos, diagnósticos y terapéuticos nuevos o no probados, si, a su juicio, ello da alguna esperanza de salvar la vida, restituir la salud o aliviar el sufrimiento. Siempre que sea posible, tales medidas deben ser investigadas a fin de evaluar su seguridad y eficacia. En todos los casos, esa información nueva debe ser registrada y, cuando sea oportuno, publicada. Se deben seguir todas las otras normas pertinentes de esta Declaración..”

Diseño Experimental Monitoreo: Requerimientos de insulina exógena Hemoglobina glicosilada Insulina porcina circulante Antígenos Anti a-Gal y hemolíticos de cerdo PERV (incluyendo familiares cohabitantes) 1 dispositivo removido 3-5 años después, para permitir el retrasplante y tratar de obtener independencia de la insulina. Detección inmunohistoquímica de: Células positivas a Glucagon Células positivas a Insulina Células positivas a CD3, CD4 y CD8 Células positivas a MIS y sox9 (Sertoli)

Seguridad Medidas de seguridad de los animales en la granja: Granja cerrada y aislada (5km). Red contra aves. Barreras contra roedores. Programa extensivo de vacunación Cuarentena estricta (Baño de entrada – Baño de salida). Monitoreo de salud aleatorio. Registro e identificación detallada de cada animal.

Seguridad Medidad de seguridad de los animales donadores. Tamiz microbiológico para: Aujeszky (elisa) Erisipela (elisa) Salmonella sp.(elisa) Salmonella sp.(cultivo de hígado y válvula ileocecal) Brucella a. (aglutinación). Influenza Porcina (inhibición de aglutinación) Leptospira (microaglutinación 16 especies). Mycoplasma hyopneumoniae (elisa) Coronavirus (elisa) Toxoplasmosis (elisa)

Contingencias Observ. Clínica o de Lab sospechosa Contactar familias y Personas cercanas Reunión de Personal Granja Productora Manual de bioseguridad de la granja Secretaría de Salud Instituciones Externa Diagnóstico Hospital OMS Cuarentena Tratamiento específico Tratamiento Seguimiento

Retrovirus Endógeno Porcino Carriles: Marcadores de tamaño Control Negativo DNA porcino DNA de Pacientes 1 2 3 4 2036 1636 1018 506 396 PERV 814 bp

Resultados Anticuerpos Anti a-Gal Tiempo Post trasplante 4500 4000 3500 12 3000 títulos 2500 2nd Tx 2° Tx 9 8 2000 12 1500 1000 11 12 500 12 5 8 PreTx Día 7 Día 14 1mes 3mes 6mes Día 7 1mes 1año Tiempo Post trasplante

Anticuerpos en el ensayo Mexicano (2000-2001) vs. El Sueco (1990-1993) Títulos de hemaglutininas IgM contra eritrocitos porcinos replicando exactamente el método de Lindeborg E. Xenotransplantation 2001: 8; 273-283. p<0.0001, Mann-Whitney U test 256 * 128 64 32 Titer (mean ±sem) 16 8 4 2 Valdes et al. Groth et al.

Requerimientos de Insulina

Resultados Paciente (% Reducción) El primer grupo de 12 pacientes trasplantados al primer año del trasplante, 6 no tuvieron reducciones, 6 mostraron reducciones variadas. Hemoglobina Glicosilada 7.4 10.8 9 13 9.9 6.6 7 12 8.9 7.1 6.7 7.9 Paciente (% Reducción)

Resultados Detección de insulina porcina en suero por HPLC

Resultados Un dispositivo fue removido de cada uno de los pacientes, para poder ser retrasplantados y posiblemente llegar a la independencia de insulina. Los dispositivos removidos fueron analizados por inmunohistoquímica para insulina, glucagon, MIS (un marcador de células de Sertoli), y CD3, CD4 y CD8.

Insulina HE 4 4 3 3 1 1 2 2

Glucagon

Sustancia Inhibidora Mulleriana (MIS)

Resultados 4 5 3 1 CD3 Humano 2 6 Q-03-164-5 4 5 3 Insulina 1 2 6

Resultados

Conclusiones No ha habido señales de zoonosis No hay complicaciones metabólicas No hay intolerancia al dispositivo o al procedimiento. El sistema inmune de los pacientes se mantiene intacto, medido por reacciones intradérmicas.

Conclusiones Respuesta Inmune Persistencia de insulina (100% de los dispositivos removidos) y células positivas a glucagon (90%) en cantidades variables después de 5 años, y de manera sorprendente, coexistiendo con linfocitos T No hay correlación entre los niveles de anticuerpo y supervivencia de las células. No hay una respuesta típica después del retrasplante

Conclusiones Modificaciones en los requerimientos de insulina exógena En 50% de los casos hubo reducciones, en algunos casos cerca de 100% por varios meses. El otro 50% pudiera no haber tenido suficientes células supervivientes, o una menor sensibilidad a la insulina. La presencia de insulina porcina se ha podido detectar en la circulación por medio de HPLC

Pasos Inmediatos Identificar los sistemas antigénicos en el cerdo que sean importantes para el xenotrasplante a humano Respuesta humoral Anticuerpos Anti a-Gal Grupos sanguíneos tipo ABO Fenómeno de Acomodamiento en los dispositivos Pruebas de reactividad cruzada para antígenos proteicos en islotes y Sertolis contra anticuerpos humanos preformados. Respuesta celular Caracterización de los linfocitos T en los dispositivos.

Pasos Inmediatos Cuantificación de la composición celular dentro de los dispositivos.

Hospital Infantil de México “Federico Gómez”

Colaboración con otras Instituciones. Dr David White, Robarts Research Institute, University of Western Ontario Dr Camillo Ricordi, Dr Luca Inverardi Diabetes Research Institute, University of Miami Dr Gordon Weir, Joslin Diabetes Center. Boston, MA Dr Robert Elliott, Diatranz Ltd, New Zealand