Claves patogénicas en LTNPs Cecilio López Galíndez Centro Nacional de Microbiología Instituto de Salud Carlos III Majadahonda, Madrid

Definiciones Definición antigua de los pacientes no progresores o LTNPs. Era una definición clínica: Pacientes con mas de 10 años de infección. Asintomático. Sin tratamiento a lo largo de la infección. Frecuencia de LTNPs en pacientes infectados: Alrededor del 10% de los infectados. No es un grupo homogéneo de pacientes Unos logran un control de la infección a niveles <2.000cp/ml o < 10.000cp/ml (son denominados los controladores virémicos). Otros logran un control casi total de la infección (los denominados pacientes elite con cargas <50 copias/ml).

Definición de pacientes ELITE El subgrupo de los controladores de ELITE es el que concentra en la actualidad la mayoría de los estudios. Estos pacientes se definen por varios criterios no exclusivos: Mas de 10 años de infección, sin síntomas y sin tratamiento con cargas virales indetectables. Cargas virales <50 cp/ml en todas o la mayoría (90%) de las determinaciones. Se admiten picos de carga viral siempre que sean menores de 2.000cp/ml y no sean en muestras sucesivas. Últimamente se están considerando dentro de esta categoría a pacientes que alcanzan cargas virales <50cp/ml en el primer año.

Definiciones Frecuencia de los pacientes Elite Varía según los estudios pero se estima que existen entre un 0.3% y un 0.5% de los pacientes infectados.

Estudios del Servicio de Virologia Molecular sobre la evolución del VIH-1 Ex vivo Estudios de Epidemiología Molecular. Evolución del virus en pacientes, principalmente LTNPs. In vitro: Análisis de la variación del virus en pases seriados.

Estudios de evolución ex vivo Estudios preliminares: Analizando la evolución viral en un grupo de pacientes durante varios años, detectamos la presencia de secuencias muy divergentes (de hasta el 9.3%) dentro de las cuasispecies. Investigamos su origen.

Mean nucleotide distances (%) 5.4 a-b 3.4 b-c 7.4 a-c Mean nucleotide distances (%) Clusters 8.5 8.8 9.3 Patient 30 Patient 10 Patient 45 1 7 12 2 23 10 14 24 19 11 9 18 21 25 4 (a/b) 8 (a/c) 17 3 5 6 20 15 22 16 8 13 (b/a) 13 4 89 95 98 100 96 93 85 75 77 70 99 87 94 76 73 80 86 90 0.02 a b c 71

Caracterización de las secuencias divergentes Estas secuencias estaban enraizadas muy cerca del origen del ancestro común mas reciente (ACMR) de las cuasispecies. Por ello parecían muy antiguas. Nos planteamos ver si era posible datar las secuencias de las cuasispecies.

Datación de secuencias del VIH-1 procedentes de pacientes Es posible reconstruir un ACMR de la epidemia en España y con el calcular la distancia de una secuencia del paciente a este ancestro. A consecuencia de la existencia de una sola epidemia por la circulación mayoritaria del subtipo B (> 95%). Existe un reloj molecular en la epidemia y las secuencias se van alejando con el tiempo del origen de la epidemia (Casado et al 2000).

V3 CURVA DATACION España 0.3 CONSENSO MRCA 0.2 Distancia genetica 0.1 0.0 1976 1980 1984 1988 1992 1996 2000 2004 2008 ± m = 0.545 0.086 % mutaciones / sitio.año Inicio de la epidemia 1977 (1968-1981) = 0.575 0.091 % mutaciones / sitio.año Inicio de la epidemia 1975 (1965 - 1980) AÑO

1 7 12 2 23 10 14 24 19 11 9 18 21 25 4 (a/b) 8 (a/c) 17 3 5 6 20 15 22 16 8 13 (b/a) 13 4 89 95 98 100 96 93 85 75 77 70 99 87 94 80 2000 86 a Patient 45 90 87 87 73 95 1993 b 100 100 c 1991 76 2001 Patient 10 a 1992 71 b 2000 a 2000 b Patient 30 1990 c 0.02

Aplicación de la datación de secuencias virales a pacientes LTNPs

(Bello y cols, 2004)

RESULTADOS La datación de secuencias de pacientes LTNPs nos ha permitido diferenciar dos grupos de pacientes: Uno, que presentaban solo secuencias ancestrales y sin evolución viral, que denominamos ANCESTRALES, y que equivalen a los pacientes ELITE. Otro, que presenta secuencias modernas y con evolución viral y que denominamos pacientes LTNPs MODERNOS y que se corresponden con los CLINICAL LTNPs y/o con los CONTROLADORES VIREMICOS.

Patogenia de la infección por el VIH-1

VIRUS ENTORNO HUÉSPED - Respuesta inmune Factores genéticos - Tropismo Celular HUÉSPED Factores genéticos

Factores del Entorno Respuesta Inmune

Caracterización de la respuesta inmune en LTNPs La respuesta inmune en los pacientes LTNPs-Elite es una respuesta CB8+ cualitativamente amplia y potente (Betts y cols, Blood 2006). Los pacientes LTNPs presentan una respuesta CD 8+ potente y multifuncional y estas células sin estimular tienen una gran capacidad supresora (Saez-Ciron y cols. PNAS 2007). La respuesta CD8+ en los controladores de elite es cualitativamente distinta de la que se produce en los progresores (Blankson y Siciliano 2008).

Mayor citoxicidad mediada por granzima B (Migueles y cols 2008). Los anticuerpos neutralizantes parecen no contribuir específicamente al control de replicación viral en los pacientes Elite (Bailey y cols Neutralizing antibodies do not mediate suppression of HIV-1 in Elite suppressors…, J.Virol 2006).

Factores “Genéticos”

Datos en favor de la hipótesis del huésped Existen pacientes que controlan naturalmente la infección : Un paciente con SIDA transmite el virus a un receptor que es capaz de controlar la infección y convertirse en Elite (Bailey y cols, J.Virol 2008). Un paciente Elite HLA B*5701 estaba infectado y se sobre-infecto con otro virus manteniéndose como LTNP (Rachinger y cols , JID 2008)

Un paciente Elite se sobre-infecta 9 años mas tarde manteniendo, sin embargo, las características de Elite (Casado y cols, JID 2007).

Datos que apoyan la hipótesis del huésped Los pacientes homocigotos para la delección de 32 aa en el correceptor CCR5, prácticamente no se infectan (Liu y cols, Cell 1996). Los pacientes heterocigotos para el mismo coreceptor progresan mas lentamente (Dean y cols, Science 1996). Ciertos HLA están sobre-representados en los LTNPs HLA B57 y B27 (Migueles y cols, PNAS 2000). Polimorfismos de los genes de los coreceptores (O´Brien y Nelson, Nature Genetics 2004).

Datos en favor de la hipótesis del huésped Estudios de Genome Wide Associations: 486 pacientes clasificados por carga viral. Análisis de 550.000 polimorfismos en el genoma. Análisis estadístico de los resultados. El resultado de uno de este tipo de estudios confirmó el papel de los factores hasta entonces conocidos como el HLA B57, pero también reveló nuevos genes como el HLA C y otros genes ZNDR1 y una RNA polimerasa (Fellay y cols 2007).

Las asociaciones genéticas obtenidas con este tipo de análisis pueden explicar desde un 15% hasta un 22% de las diferencias de la carga viral (J. Fellay et al, 2007). Existen también estudios funcionales que mediante la utilización de RNA interferente han descrito otros genes involucrados en la replicación del VIH-1 (por ej: Rab 6, Vps 53, Karioferina, etc… (Brass y cols, Science 2008).

Factores virales

Hipotesis virológica: ¿ Pueden existir pacientes VIH o grupos de pacientes en que la causa de su no evolución sea EL VIRUS?

Respuesta Evidencias: Paciente no progresor con delección en nef (Kirchoff y cols, NEJM 1995). El grupo de pacientes infectados en el Banco de Sangre de Sidney (Deacon y cols, Science 1995). Otros pacientes LTNPs presentan mutaciones poco frecuentes en genes auxiliares (como rev: Iversen y cols J Virol 1995, o a varios genes a la vez, Alexander y cols J.Virol 2000) o en env (Calugi y cols J.Virol 2006). El grupo de Saksena tras secuenciación del genoma completo, comprobó que no existían grandes alteraciones en los distintos genes virales pero habia una también una respuesta inmune especial (Wang 2002).

Estudios con controladores de Elite

Estudios evolutivos de pacientes Elite en nuestro laboratorio Estudio virológico y de evolución viral de 3 pacientes Ancestrales en comparación con pacientes LTNPs Modernos

A) LTNP 3 LTNP 20 LTNP 56 06/98 02/99 02/00 07/01 04/02 11/04 06/05 LAI 64 63 62 53 94 98 61 100 0.01 56.11.64 56.11.70 56.11.10 56.11.80 56.11.55 56.11.21 56.11.22 56.11.9 56.11.11 56.11.5 S61 20.1.36 65 64 99 92 100 0.01 LAI S61 20.2.7 72 90 06/98 02/99 02/00 07/01 04/02 11/04 06/05 66 02/03 10/03 04/04 01/05 10/04 06/05 04/06 83 96 68 66 100 3.5.59 S61 LAI 0.01

B) LTNP 30 94 LTNP 7 100 100 70 100 100 78 100 63 64 70 84 89 71 59 77 88 100 66 95 100 78 100 83 60 81 100 98 54 93 100 100 97 01/98 12/98 04/00 09/01 04/02 09/02 04/04 85 69 99 09/02 09/04 03/05 80 87 100 62 90 LAI S61 100 96 S61 LAI 0.02 0.02

LTNP 3 LTNP 20 LTNP 56 Δ WT U3 1 DIS SD ψ PBS loop TAR poly A CCGAGCAA 563 AGTAGTGTGTG GGCGCGAGAG 228 bp 791 Δ WT U3 1 DIS SD ψ AUG PBS loop p24 Gag-Gag Pol t-RNA TAR poly A p17 5´ CCCTCAGACCCTTTTAGTCAG 1705 1088 bp 617 1227 533 bp ATATCACCTAGA 694 CTCTCTCGACGCA 738 858 120 bp GAAGCGCGCACGGCAAGAGGCGAGGGGCGG GGGGAAAGAAAAAA LTNP 3 Protease Reverse transcriptase RNase H Integrase Vif ACT.AAA.GAA T K E 3´ 247bp 4864 5111 pol gene 2252 928 25 TTA.GTA.AAA L V K

CONCLUSIONES Existen pacientes ELITE con importantes delecciones en su genoma proviral. Estas delecciones tienen una mayor presencia en los pacientes Elite que en los LTNPs virémicos o los típicos o rápidos.

Estos pacientes, que presentan mayoritariamente virus deleccionados, muestran además uno o más factores genéticos asociados con el control de la enfermedad. Estos resultados concuerdan con la revisión sobre los Elite de Deeks y Walker 2007. Existe replicación residual en los 3 pacientes estudiados.

Existe replicación viral residual en los pacientes Elite. Hemos detectado pequeños clusters de secuencias con evidencia de evolución viral en 3 pacientes controladores de Elite. Hemos cuantificado esta replicación que, en el limitado numero de pacientes estudiados, es menor del 2%.

Se han obtenido mutantes de escape a epítopos CTLS conocidos y el número de mutaciones de escape aumenta con la cantidad de replicación (Miura y cols, J.Virol 2009) Con un ensayo de detección de carga viral mas sensible (<3.5cp/ml) se observó que existía replicación persistente en 45 de los 46 de pacientes Elite estudiados (Hatano y cols, J.Virol 2009).

Evidencias virológicas en pacientes Elite. El grupo de Eric Arts ha comprobado que las envueltas de pacientes Elite solo pueden replicar en células con una mayor concentración de CD4+ y CCR5 y replican muy mal en CMSP (Jensen et al 2009, Plos Pathogens).

Nuestro grupo, clonando envueltas de varios pacientes Elite hemos comprobado que replican, pero a niveles muy bajos en células U87-CCR5 y además no son capaces de replicar en PBMCs de distintos donantes.

Infección U87 CCR5 Infección CMSPs

Aplicación sobre la contribución de factores genéticos y virológicos en los distintos grupos de pacientes VIH-1

Marcadores virologicos y genéticos estudiados. Datos Virológicos: Carga viral y proviral Datación Tropismo derivado del genotipo Marcadores genéticos: seleccionados entre los que tenían mas soporte en estudios genéticos previos (Fellay y cols 2007) Polimorfismos de CCR2 Polimorfismos de CCR5 CCL3L1 (nº de copias) HCP HLA-C ZNRD-1 HLA- A1, A2 y HLA B.

Allelic frequency or proportion CCR2 V64I 32 D CCR5 CCR5_H+/H+ CCR5_HHE/HHE CCR5_P1/P1 HCP5 ZNRD1 HLA-C HLA-A+ HLA-B+ HLA-B- 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 EC LTNP P RP CNP CCR2 CCR5_ V64I H+/H+ HHE/HHE P1/P1 r2 0.12 0.72 0.79 0.08 0.42 0.35 0.10 0.74 0.16 0.93 0.58 P-value 0.57 0.07 0.02 0.65 0.50 0.29 0.60 0.06 0.51 0.01 0.14 Allelic frequency or proportion

CONCLUSIONES Existe una progresiva perdida de factores genéticos de protección y una acumulación de factores de progresión en los distintos grupos desde los pacientes Elite a los pacientes progresores rápidos. Los pacientes con progresión rápida muestran una baja frecuencia de factores protectores y una acumulación de factores de progresión.

CONCLUSIONES Las definiciones clínicas de pacientes VIH están apoyadas, en general, por factores genéticos del huésped en particular HLA-B, HLA-C, y haplotipos protectivos CCR5/CCR2 y por factores virales sobre todo por la presencia de virus con características ancestrales.

CONCLUSIONES GENERALES Estudiar la evolución viral en los pacientes LTNPs genera una información muy valiosa que ayuda a comprender y puede anticipar la patogenia. No parece existir una única solución para el control de la replicación viral en los pacientes infectados por el VIH-1.

La patogenia de la infección del VIH-1 es el resultado de una combinación compleja de factores del huésped, de la respuesta inmune y de las características del virus.

VIRUS ENTORNO HUÉSPED Respuesta inmune Factores genéticos Tropismo Celular HUÉSPED Factores genéticos

VIRUS ENTORNO HUÉSPED Respuesta inmune Factores genéticos Tropismo Celular HUÉSPED Factores genéticos

VIRUS ENTORNO HUÉSPED Respuesta inmune Factores genéticos Tropismo Celular - HUÉSPED Factores genéticos

Tamara Álvaro Cifuentes Gonzalo Bello Betancor Cecilio López Galíndez Concepción Casado Maria Pernas Virginia Sandonís Tamara Álvaro Cifuentes Gonzalo Bello Betancor Cecilio López Galíndez Centro Nacional de Microbiología Instituto de Salud Carlos III Soledad García Carmen Rodríguez Jorge del Romero Centro Sanitario Sandoval IMSALUD Sara Colombo Amalio Telenti Microbiology Institute University of Lausane

Entorno Tropismo viral: Los virus CXCR4 y dual trópicos son mas patogénicos. Existe mucha mayor replicación en linfocitos CD4+ que en macrófagos u otros tipos celulares.

Table 2. Immunological and genetic characteristics of the patients