La Medicina Genómica en la Práctica Clínica Dra. med Laura Martínez de Villarreal Departamento de Genética Facultad de Medicina y Hospital Universitario UANL

Índice Bases moleculares Medicina Genética Vs Medicina Genómica Variantes genómicas El Genoma Humano Pruebas de laboratorio Contribución del Genoma Humano en Medicina Aplicaciones Fortalezas y limitaciones de la medicina genómica

DNA: Soporte de la información genética

Dogma central Moleculas RNA Proteinas DNA Traducción Transcripción Replicación

La Antigua Genética Enfermedades Cromosómicas: Ganancia o pérdida de un cromosoma o una parte Ej., Sd. Down, Sd. Turner, Sd. Cri-du-chat Monogénicas: Mutación de un solo gen Ej., Fibrosis quística, Sd. Marfán, Fenilcetonuria, Charcot Marie Tooth.

Cariotipo bandas GTG

La Antigua Genética Estas condiciones: Son de gran importancia para los individuos y sus familias. Aún agrupadas son raras. La mayor parte de la población no está afectada. La Genética jugaba un pobre papel en los servicios de salud y la sociedad.

La Antigua Genética Estas condiciones “raras”: La atención del paciente genético involucra un reducido grupo de especialistas (médicos genetistas, consejeros genéticos) con involucro ocasional de otros médicos generales o especialistas.

La Antigua Genética Investigación: Hasta hace 20 años la genética no había resuelto preguntas básicas, pero fue de gran apoyo para el desarrollo de herramientas en el laboratorio.

Revolución tecnológica

Obtención de ADN y secuenciación Reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Método de secuenciación de Sanger (SAGE). Clonación en vectores (BAC´s, YAC´s) GRANDES CANTIDADES DE ADN

Herramientas moleculares ELECTROFORÉSIS EN GEL SECUENCIACIÓN A G C T A G C T CÁNCER NORMAL

Variantes genéticas Las variantes tienen dos componentes: “alelos” (genes paterno y materno). Cuando la frecuencia de estos es >1% se consideran polimorfismos. El término mutación se utiliza cuando hay cambios en ADN que se consideran patológicos (Ej: FQ) o cambios en el DNA recientes (no germinales) N Engl J Med 2010;362:2001-11.

Variación genómica Los eventos que contribuyen a la variación genómica son: Mutaciones puntuales Inserciones/deleciones Re-arreglos estructurales. N Engl J Med 2010;362:2001-11.

Patogénesis de mutaciones Las Ins/Dels y los SNPs pueden conferir riesgo o protección contra enfermedades Re-arreglos estructurales se asocian a estados patológicos. CNV (variable número de copias) se han ido asociando a un mayor número de enfermedades (autismo, esquizofrenia)

Variación Genómica SNP´s (polimorfismos de un solo nucleótido) Mutaciones presentes en >1% población C>T más frecuentes 1.8 millones 1 cada 800 pb 60 000 SNP´s MTHFR y DTN BRCA y Ca. de mama

Polimorfismos Se han asociado a enfermedades complejas (enfermedad coronaria, DMT2). Las enfermedades complejas son multifactoriales: genes y medio ambiente. Pueden resultar de variantes comunes y raras.

Epigenómica Alteraciones en la expresión génica sin cambios en la secuencia del DNA. Ocurren por metilación en sitios CpG. Patrones anormales de metilación están asociados a cáncer: Hipometilación de oncogenes Hipermetilación de genes supresores

Proyecto del Genoma Humano

Metas Identificar genes que contribuyen a enfermedades Tipo de variantes genéticas y su contribución al fenotipo Desarrollo de pruebas diagnósticas Entendimiento de la fisiopatología Desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas.

Ramas de la Biología Beneficiarias del Conocimiento del Genoma Humano Medicina Bioinformática Biotecnología

Medicina Genómica Gen Genoma Medio ambiente Medicina Genómica

Medicina Genómica Interacción entre el genoma y factores no genómicos y su asociación son salud y enfermedad. Proporciona nuevas herramientas diagnósticas y terapéuticas para enfermedades multifactoriales Incorporación de pruebas genómicas o terapéuticas al cuidado diario. Ha cambiado el entendimiento de la biología de la mayoría de las condiciones médicas.

Medicina Genómica Enfermedades: Causadas por mutaciones en genes: Cáncer de colon, cáncer de mama, arterioesclerosis, enfermedad inflamatoria intestinal, Alzheimer, DMT2, etc. Prevenibles por mutaciones en genes: HIV (CCR5), Posiblemente: arterioesclerosis, cáncer, diabetes, otros.

Medicina genómica Se han identificado contribuciones genéticas para enfermedades comunes relacionadas con genes de baja frecuencia y alta penetrancia. HNPCC (cáncer de colon) BRCA1 y 2 (Ca. ovario y mama) MODY 1,2,3… (diabetes) Alfa-sinucleína (E.Parkinson)

Medicina Genómica A nivel de población general la principal contribución ha sido la identificación de genes de alta frecuencia y baja penetrancia. ApoE (Alzheimer) Factor V Leiden (trombosis) CCR5 (resistencia a infección HIV/AIDS)

Medicina Genómica Conocimiento de predisposición genética permitirá: Tamiz individualizado Cambios de estilos de vida individualizados Terapia pre-sintomática: Ej: Ca de colon, hipertensión.

Medicina Genómica Farmacogenómica: Terapias individualizadas basadas en las determinantes genéticas que condicionan respuesta a medicamentos. Uso de medicamentos que pudieran ser rechazados por sus efectos adversos. Nuevos medicamentos para genotipos de enfermedades específicos.

Métodos de estudio Estudios de ligamiento: Familias (haplotipos) Estudios de Asociación: Casos y Controles Clonación Posicional Clonación Funcional.

Herramientas Dx. Genética: Ambas = análisis de un solo gen o panel Enfermedades Raras: Genes causales Enfermedades comunes: Genes de riesgo (Historia clínica) Ambas = análisis de un solo gen o panel ScienceTranslationalMedicine.org 17 July 2013 Vol 5 Issue 194

Herramientas Dx. Molecular PCR: Tiempo real, mutación dirigida, metilada, múltiplex. Microarreglos: SNPs, RNA, ADN, BACs, Tejidos, oligos. MLPA Secuenciación Monogénica Secuenciación de nueva generación WGS

Expresión Génica: Microarreglos Estudio de patrones de expresión génica. La cantidad de fluorescencia equivale a la expresión del gen

Microarreglo Farmacogenómica Roche Product CYP 450 Genotyping (drug metabolizing system) From: Nature Biotechnology 2003 21:959-60

Secuenciación

Proteómica Investiga los patrones y niveles de expresión génica en células enfermas las cuales pueden analizarse para construir bases de datos de los perfiles de expresión.

Diagnóstico Molecular Aplicaciones Identificación preclínica o pre-sintomática de individuos con una condición hereditaria. Bases moleculares de una enfermedad (polimorfismos funcionales o genes modificadores). Farmacogenómica: determinantes genéticas que influyen en la respuesta a medicamentos. Primer of Molecular Genomics Mayo Clinic Proc.,

Aplicaciones Clínicas

Pre-Sx Cardiología Sd. Hereditarios de arritmia: Brugada, QT-largo. Cardiomiopatías: dilatada, hipertrófica, ventricular derecha arritmogénica. Enfermedades con heterogeneidad genética. Reto diagnóstico de LQTS: 5 genes codificantes de canales iónicos explican el 66% de los casos Actualmente se utiliza el tamiz ECG. Solo el 25% de los electrofisiólogos recomiendan Tx con b- bloqueadores en asintomáticos basados en ECG.

Caso Caso de un masculino que fallece cuando estuvo a punto de ahogarse. La autopsia revela mutación en KVLQTI (canal de potasio). La hija con ECG normal. Al inicio no se indica tratamiento. El análisis molecular revela que es portadora de la mutación del padre. Se recomienda tratamiento que de otra manera no se hubiera indicado. Sd. muerte súbita infantil: se asocia a mutaciones en gen de canal de sodio SCN5A

Bases moleculares ECA Polimorfismo D/I (deleción/inserción) Actividad D > I Genotipo DD asociado a múltiples trastornos: infarto, enfermedad coronaria, nefropatía diabética, asma. No se recomienda aún como prueba de tamiz

Farmacogenómica Cardiología Uso de diuréticos en hipertensión: SNP C825T de la sub unidad b3 de la proteína G, produce una menor respuesta al Tx con hidroclorotiazida. SNP del gen de la a- aducina produce mejor respuesta a Tx con diuréticos y mayor riesgo a infarto. Se sugiere análisis genómico antes de empezar Tx.

Cardiología Respuesta a anticoagulante Warfarina Clopidrogel. Influencia de genes: VKORC1, CYP2C9, GGCX y CYP4F2 genes Se recomienda buscar mutaciones patógenas. Clopidrogel. Influenciado por genes metabolizadores (CYP2C9) No hay recomendación de prueba No respuesta = cambio de medicamento.

Hemocromatosis hereditaria Enfermedad monogénica más frecuente Portadores Hetero: 1/20 , Homo 1/250 Penetrancia variable Riesgo de Cirrosis (hipertensión portal ), Cáncer Gen HFE, diagnóstico y portadores.

Bases moleculares Hematología Factor V Leiden (R506Q) : polimorfismo funcional que influye en un proceso patológico Prueba molecular diagnóstica de rutina en estados hipercoagulables. Factor de riesgo para trombosis venosa y embolismo pulmonar. 20% de pacientes con trombosis venosa profunda 60% de mujeres embarazadas con trombosis Se recomienda en casos de trombosis: < 50 años Sitios inusuales Historia familiar Recurrente Mujeres embarazadas Mujeres con AO Familiares con TP < 50 a Mujeres con infarto , fumadoras < 50 años

Pre Sx. Oncología Variación en susceptibilidad a cáncer: Exposición a aminas aromáticas (tabaco y colorantes) Enzima destoxificante: N-acetiltransferasa NAT2 Gen normal: acetiladores rápidos Gen mutado: acetiladores lentos 50% de la población son acetiladores lentos y tienen mayor riesgo de cáncer por exposición a aminas

Pre Sx. Oncología Ca colon: 20% : agregación familiar de los cuales 1/3 se asocian a HNPCC o PAF ambas AD Pruebas predictivas para familiares: HNPCC y APC HNPCC: Inmunohistoquímica de enzimas reparadoras: hMLH1, hMLH2, MSH6, e inestabilidad de microsatélites en tumor, y secuenciación en línea germinal. PAF: Mutaciones germinales de proteína C y electroforesis en gel y análisis de proteína trunca

Oncología Ca mama: BRCA1 y BRCA2 riesgo de Ca de mama de 50-85% y de ovario de 15-45%. Debe tamizarse en mujeres con riesgo: Ca de mama hereditario. La aplicación de pruebas genéticas-genómicas a sujetos asintomáticos depende de la sensibilidad, especificidad y confiabilidad además de costos y accesibilidad.

Indicaciones para Prueba BRCA > 18 años Mujer con Ca de mama / ovario < 45 años Mujer con Ca de mama/ ovario bilateral o metástasis múltiples. Mujer con Ca de mama/ovario a cualquier edad con un familiar de primer grado afectado Dx < 45 años. Mujer con Ca de mama /ovario con dos familiares afectados

Bases moleculares Oncología Ca mama HER-2/neu (receptor del factor de crecimiento epidérmico) Sobreexpresión en tumores (mama y ovario) es indicador de pobre pronóstico: mayor recurrencia y menor respuesta a Tx. Farmacogenómica: Trastuzamab actúa sobre células que sobre-expresan este gen. BRCA. Perfiles de expresión (Microarreglos) metástasis y respuesta a tratamiento (Oncotype y Mamaprint)

Oncología Linfoma difuso de células grandes (DLBCL): Perfil de expresión (microarreglos): Identificación dos sub tipos: Análogo a célula B germinal (mayor sobrevida y mejor respuesta a Tx.) Análogo a célula B periférica La constitución genómica de los pacientes con neoplasias malignas modifica la práctica clínica

Farmacogenómica Oncología Bases moleculares y Tx específico de: Leucemia mieloide crónica t 9-22 Cr. Filadelfia = gen quimérico bcr-abl Actividad de tirosin cinasa = Trastuzumab Leucemia pro-mielocítica aguda t 15-17 altera receptor del ácido retinóico (RAR) impidiendo maduración y muerte de promielocitos. Tx- derivados de vitamina A .

Farmacogenómica Oncología Tiopurin metil transferasa (TPMT): responsable del metabolismo de Azatioprina 1/300 sujetos no tienen actividad de esta enzima 10% son hipometabolizadores Responsable de leucopenia en un grupo de paciente Tx con Mercaptopurina. Se debe buscar el genotipo en pacientes que van a recibir Tx (enfermedad intestinal inflamatoria, leucemia)

Pre-sintomático Gastroenterología Familiares de pacientes con: Esofagitis por reflujo, adenocarcinoma de esófago y esófago de Barret: tienen 2X > riesgo de desarrollar la enfermedad Lo anterior sugiere un factor genético subyacente Debe vigilarse a los familiares con estas enfermedades Genes asociados MSR1, ASCC1 y CTHRC en el 11% de casos

Bases Moleculares Gastro Esófago de Barret: se están buscando marcadores genéticos de progresión de la enfermedad. Progresión de hepatitis C: se asocia a sobreexpresión de genes inmunomoduladores y pro-apotóticos. Cirrosis biliar hepática: sobreexpresión de genes de vías Wnt y Notch (c-jun, c-myc, c-fos) Investigación: arreglos de expresión para genes de riesgo de adenocarcinoma hepático, colangiocarcinoma e hígado graso Colangitis esclerosante y riesgo de cáncer: uso de FISH para aneuploidías en muestras obtenidas por colangiopancreatografía retrógrada (cepillo)

Farmaco Gastro- Psiq Crohn – CUCI y resistencia a corticoesteroides: No expresión del receptor b de glucocorticoides Gen de resistencia a multifármacos PG17A CYP2D6: gen de citocromo asociado al metabolismo de psicofármacos y medicamentos para re-capatación de serotonina afecta la tasa metabólica de los fármacos W/W= Metabolizadores extensos W/w = Metabolizadores intermedios w/w= Metabolizadores lentos WW/WW= Ultrarápidos Variación étnica: alrededor del 6.7% son metabolizadores lentos (riesgo de intoxicación)

Estudios de asociación genómica (GWAS) Han sido de utilidad proporcionando información sobre el papel de proteínas y vías biológicas en la patogénesis de las enfermedades. Las cuales sirven como blanco terapéutico Sistema de factor de complemento en la degeneración macular Vía autofágica en enfermedad inflamatoria intestinal

Análisis de SNPs Los estudios de GWAS y microarreglos de SNPs permiten analizar la asociación de polimorfismos y condiciones complejas en cohortes. La mayoría de los SNPs asociados se encuentran en regiones no codificantes. La mayoría de los SNPs asociados con enfermedades comunes aportan una heredabilidad de riesgo del 5- 10% Actualmente no se recomiendan como marcadores de riesgo para enfermedad en la clínica. ScienceTranslationalMedicine.org 17 July 2013 Vol 5 Issue 194

GWAS Riesgo de GWAS Hallazgos incidentales Se deben entregar al médico y si es posible se debe discutir con el paciente desde antes de enviar las muestras para estudio (American College of Medical Genetics (ACMG) ScienceTranslationalMedicine.org 17 July 2013 Vol 5 Issue 194

Enfermedades complejas Las enfermedades complejas se deben al efecto conjunto de susceptibilidad genética (poligénica) y factores ambientales. La diferencia en riesgo entre portadores y no portadores es mínima El valor predictivo basado en una sola variante genética no es informativo. La predicción de enfermedades complejas debe implicar el análisis simultáneo de múltiples loci : Perfil genético. Deben ser establecidos para cada población y actualmente no están aprobados para su uso generalizado.

Enfermedades complejas Estudio del valor predictivo de variantes genéticas para el desarrollo de ciertas enfermedades: DMT2, Enfermedad coronaria, Infarto miocardio, degeneración macular asociada a la edad. Con excepción de la enfermedad macular asociada a edad e hipertrigliceridemia el valor predictivo de la mayoría de las enfermedades es limitado. Enfermedad macular = cinco genes Hipertrigliceridemia= siete variantes genéticas Human Molecular Genetics, 2008, Vol. 17, Review Issue 2

Enfermedades complejas Las pruebas de susceptibilidad para enfermedades complejas deben mejorar la predicción establecida por los factores de riesgo convencionales. En el caso de DMT2, enfermedad coronaria y cáncer de próstata, las variantes genéticas analizadas no mejoran la predicción comparada con los factores de riesgo clásicos. Falta llevar acabo el análisis de un mayor número de Loci TCF7L2, Calpain 10, KCNJ11 son los más frecuentemente asociados a DMT2 en la mayoría de las poblaciones

Validación Los estudios de predicción debe ser realizados en poblaciones representativas para donde se desean aplicar las pruebas. Los estudios de casos y controles se utilizan para ver asociación. Si se quiere evaluar riesgo y valor predictivo se deben realizar estudios de cohorte a largo plazo y tomando en cuenta factores de riesgo clásicos. Los estudios de predicción deben ser validados. En el caso de predicción se prefiere la búsqueda de biomarcadores.

Guía para la práctica clínica (CDC) Tamiz Neonatal Metabólico BRCA1/2: Historia familiar Sd. Lynch (HNPCC): paciente < 50 años, familiares primer grado. Hipercolesterolemia Familiar. HLA para Abacavir.

Guía (CDC) Análisis de mutaciones de KRAS en pacientes considerados para terapia con anti EGFR (Cáncer de pulmón de cel. No pequeñas) Inhibidores de tirosin cinasa (predicción de no reespuesta a cetuximab y panitumumab) Her2 (Ca mama) Hemocromatosis

Recordar El avance del conocimiento en medicina genómica ha permitido conocer la asociación de genes de riesgo para enfermedades comunes. Grupos poblacionales específicos deben ser tamizados para el diagnóstico pre-sintomático. La aplicación de la farmacogenómica puede evitar efectos adversos y mejorar la respuesta clínica a los medicamentos. Además de que ha permitido el desarrollo de terapias específicas.

Recordar Las herramientas de diagnóstico molecular ayudan en el diagnóstico y pronóstico de las enfermedades. En enfermedades como diabetes y coronariopatías los factores de riesgo clásicos aún tienen mayor poder predictivo. Los GWAS no deben hacerse en forma individual si no hay una responsabilidad para la interpretación y evaluación de hallazgos.

Gracias

Enfermedad Locus Gen Cr Prot. Herencia Edad años PARKINSON PARK1 SNCA 4q21 a-sinucleína AD 46 PARK3 ? 2p13 59 PARK5 UCHL 4p14 Ubiquitina carboxil hdrolasa 50 PARK8 LRRK2 12q12 Leucine rich repeat cinasa 35-78 PARK2 Park2 6q25 Parkina AR 20-40 PARK6 Pink1 1p36 Serine threonine K 45-68 PARK7 Park7 DJ-1 variable

Alzheimer

Herramientas Dx sequence-specific binding of short complementary DNA probes (oligonucle- otides) to DNA samples from patients in order to detect mutations associated with single-gene dis- orders. Generally, these assays rely on the poly- merase chain reaction (PCR) to amplify regions of interest in a patient’s DNA; the PCR product is then analyzed for the presence or absence of mutations. New approaches, including the use of gene chips and sequencing, are rapidly eclipsing traditional methods of detecting human genetic variation and mutations.

Introducción Actualmente es más común buscar los factores genéticos responsables de las enfermedades raras. En las enfermedades comunes para la evaluación de riesgo se sigue utilizando factores de riesgo clásicos obtenidos en la HC. Debido a la diversidad humana no se considera que existe una secuencia genómica Humana “Normal”. En sitios específicos del genoma existen diferencias “variantes” que se consideran como “normales” (WT) debido a su frecuencia en la población. N Engl J Med 2010;362:2001-11.

Our initial concerns were cost and data accuracy, but the major challenges turned out to be the logistics of delivering genome sequence information to clinicians, how clinicians use the data, and how patients and their families deal with the secondary (incidental) fndings.