EXPRESIÓN DE PROTEÍNAS MEDIADORAS DE APOPTOSIS EN CÉLULAS DE MÚSCULO LISO DE AORTA Perales, S; Linares, A; Palomino,R; Alejandre, M.J Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Facultad de Ciencias, Universidad de Granada INTRODUCCIÓN La célula muscular lisa (SMC) junto con el endotelio constituye el principal componente de la pared vascular. Los eventos de proliferación y apoptosis en estas células tienen una gran importancia no sólo en la remodelización fisiológica del vaso sino también en procesos patológicos como la aterosclerosis (1). Uno de los primeros cambios que se producen en la aterosclerosis, cuando la enfermedad es aún reversible, es la modulación de las SMC desde un fenotipo contráctil a sintético. Las SMC sintéticas se muestran desdiferenciadas, son muy proliferativas y capaces de producir una gran cantidad de matriz extracelular(2). Estas SMC serian las que migrarían desde la media a la íntima convirtiéndose en el principal componente celular de la neoíntima en la aterosclerosis. Uno de los factores que puede inducir estos cambios es el colesterol de la dieta (3). Los eventos apoptóticos son muy abundantes en la aterosclerosis avanzada (placa aterosclerótica), pero también el los estados iniciales, en los cuales se rompe el equilibrio proliferación muerte celular a favor de la proliferación pero a ala vez ests células quedan marcadas para la apoptosis (4). La dieta de colesterol induce estos cambios(5). En este sentido, se conoce que la acumulación de lípidos en las SMC, procedentes de animales hipercolesterolémicos, incrementa la expresión de la proteína proapoptótica Bax (6). En este trabajo hemos investigado los cambios inducidos por una dieta de colesterol en cultivos primarios de SMC respecto a proteínas mediadoras de apoptosis: Bax, Bcl-X L y Bcl-2. Además hemos analizado si estos cambios revierten al sustituir la dieta rica en colesterol por una dieta rica en aceite de pescado. Por otra parte, mediante estudios in Vitro hemos estudiado los cambios que sufren los distintos cultivos al tratarlos con sustancias asociadas con la aterosclerosis como son el 25-hidroxicolesterol el óxido nítrico. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL Animales y dietas Se utilizaron pollos recién nacidos (Gallus domesticus) de la raza White Leghorn. Se alimentaron ad libitum desde su nacimiento hasta los 20 días con tres tipos de dietas: Grupo- C dieta normal, grupo-Ch dieta de colesterol al 5%, y grupo-A dieta rica en colesterol durante 10 días y después dieta rica en aceite de pescado 10% otros 10 días. Cultivo de células El cultivo primario de SMC se obtuvo a partir del arco aórtico de los pollos. Las células se obtuvieron mediante el método de los explantes descrito por Chamley-Campbell et al. modificado en nuestro laboratorio (3). Tratamientos in Vitro Las células se incubaron con distintas moléculas presentes en una aterosclerosis temprana como son el 25- hidroxicolesterol que se usó en medio completo a una concentración de 20 µg/ml durante 24h y el Nitroprusiato sódico como donador de óxido nítrico que se usó a 0.6 mM durante 8h. Citotoxicidad y viabilidad celular La citotoxicidad se analizó mediante el ensayo con MTT, el cual nos proporciona un recuento de la viabilidad celular. Western-Blot Las proteínas se obtuvieron lisando unas 10 7 células en tampón RIPA. Para la electroforesis en SDS-PAGE al 12% se usaron 70µg de proteínas, y se transfirieron a una membrana de PVDF. Se usaron los siguientes anticuerpos: anti-BclX L (Cell Signalling), anti-Bax (Santacruz), anti-Bcl2 (Transduction Laboratories).La detección se realizó mediante el sistema ECL. RESULTADOS Y DISCUSIÓN Hemos investigado la expresión de proteínas de la familia Bcl-2 en los tres tipos de cultivos de SMC (C, Ch y A), tanto a niveles basales como tras la adición de sustancias presentes en la aterosclerosis. Las concentraciones y tiempos de incubación para el 25-hidroxicolesterol y el nitroprusiato sódico se determinaron mediante pruebas de citotoxicidad (MTT), así elegimos una concentración de 25-hidroxicolesterol de 20 μg/ml durante 24h y de 0,6mM 8h.(no se muestra) La expresión de Bax (Fig.1A) es baja en los tres tipos de células. Al adicionar 25-hidroxicolesterol, se incrementa en los tres tipos. Sin embargo con el nitroprusiato no se aprecian cambios (Fig. 1B). Bcl-X L (Fig. 1C) se expresa más en SMC-A. al incubar con 25-hidroxicolesterol, se incrementa para SMC-C, mientras que disminuye para SMC-A y no varia SMC-Ch. La acción del nitroprusiato produce un marcado descenso en los niveles de Bcl-X L especialmente pronunciado para SMC-Ch (Fig.1D) La expresión de Bcl-2 (Fig.1E) a nivel basal es mayor para SMC-Ch. El 25-hidroxicolesterol, no parece tener efecto sobre Bcl-2 excepto para las SMC-A donde aumenta. La acción del nitroprusiato produce un aumento en la expresión de Bcl-2 para las SMC-C; si embargo lo hace disminuir en las SMC-Ch. Fig.1 Western-blots de Bax, Bcl-XL, Bcl-2 a nivel basal y después de los tratamientos con 25-hidroxicolesterol o nitroprusiato en SMC Fig.2. Expresión de Bax, Bcl-XL, Bcl-2 a nivel basal en SMC. Estos resultados están normalizados respecto al control. Tabla 1 Tabla 2 Tabla 3 Fig.3.-Ratio de los niveles de expresión en SMC: Tabla 1, SMC a niveles basales; tabla 2, SMC tratadas con 20µg/ml de 25-Hidroxicolesterol y tabla 3, SMC tratadas con 0,6 mM de Nitroprusiato sódico. REFERENCIAS 1.- Isner JM, Kearney M, Bortman S, Passeri J: Apoptosis in human atherosclerosis and restenosis. Circulation 1995, 91: Faggiotto A. New Trends in Atherosclerosis Research.Atherosclerosis. Rev Physiol 1990, 21: Carazo A, Alejandre MJ, Díaz R, Rios A, Castillo M, Linares A. Changes in cultured arterial smooth muscle cells isolated from chicks upon cholesterol feeding. Lipids. 1998, 33: McCarty N.J, Bennett M.R. The regulation of vascular smooth muscle cells apoptosis. Cardiovascular Research 2000, 45: Hasdai D, Sangiorgi G, Spagnoli LG, Simari RD, Holmes DR Jr,Carlson PJ, Schwart RS, Lerman A. Coronary artery apoptosis in experimental hipercolesterolemia. Aterosclerosis. 1999; 142: Yao PM, Tabas I. Free colesterol loading in macrophages is associated with widespread mitochondrial dysfuntion and activation of de mitochondrial apoptosis pathway. J. B. C 2001, 276: Hayakawa et al: Apoptosis and Overexpression of Bax Protein in Smooth Muscle Cells within Intimal Hyperplasia of Human Radial Arteries, Arteriorcler Tromb Vasc Biol (9): Sudesh A, Guy M.C, et al. Stat1-dependent, p53 independent Expression of p21 modulates oxysterol-Induced apoptosis. Molecular and cellular biology 2002, 22,no7: Herbert K.F. Lau. citotoxicity of nitric oxide donors in smooth muscle cells is dependent on phenotype, and mainly due to apoptosis. Atherosclerosis 2003,166: (A (B (C (D (E Si consideramos estos resultados como ratios de expresión entre moléculas antiapoptóticas/proapoptóticas (Fig.3), vemos que a nivel basal (Fig.2; Fig.3, tabla1) el ratio Bcl-2/Bax es menor para las SMC-Ch. Esto nos sugiere que existe una mayor inducción a la apoptosis en las SMC-Ch. Estos resultados son consistentes con los estudios previos que muestran que Bax se expresa en SMC contráctiles y sintéticas pero que bcl-2 sólo se detecta en las de fenotipo contráctil (7). Respecto a las SMC-A, el ratio Bcl-X L /Bax se incrementa significativamente, mientras que Bcl-2/Bax decrece aunque menos que para SMC-Ch. Esto nos sugiere que existe una menor inducción a la apoptosis y que por tanto el cambio la supresión de la dieta de colesterol y la nueva dieta con aceite de pescado no sólo produce una reversión incluso una cierta protección. La acción del 25-hidroxicolesterol (fig.3,Tabla 2) incrementa la expresión de Bax principalmente en las SMC-Ch, y menos en las SMC-A. Por tanto esto confirma una cierta protección la apoptosis. Estudios previos muestran que el efecto de lo oxiesteroles esta mediado por p21, el cual es un mediados de p53. en este sentido se ha visto que la sobrexpresión de p21 induce la expresión de bax pero que no cambia la de bcl-2 (8). Nuestros resultados serían compatibles con estos estudios. El óxido nítrico (NO) a través del nitroprusiato (Fig.3,tabla 3) muestra un efecto opuesto sobre las SMC-C y SMC- Ch, ya que el ratio Bcl-2/Bax se incrementa para las SMC-C, pero decrece para las SMC-Ch. Algunos estudios muestran que el NO puede tener una acción protectora a la apoptosis en las arterias normales. Pero que sin embargo en una arteria aterosclerótica puede inducir la apoptosis. Esto es además compatible con los estudios que muestran cambios en los ratios Bcl-2/bax para las SMC de fenotipo sintético (9). In Sin embargo el ratio Bcl- X L /Bax para las SMC-A se incrementa de nuevo respecto a las control, lo que nos sugiere una protección respecto a la apoptosis. Incluso el ratio Bcl-2/Bax nos muestra una posible reversión respecto a las SMC-Ch. CONCLUSIÓN : Las SMC procedentes de pollos alimentados con dieta de colesterol sufren una modulación compatible con un cambio de fenotipo contráctil a sintético, semejante a los estadíos iniciales de un proceso aterosclerótico aún reversible