Dr. Jaime Rodríguez Laboratorio de cultivo celular Facultad de Ciencias de la Salud Universidad de Talca Julio 2005.

Presentación del tema: "Dr. Jaime Rodríguez Laboratorio de cultivo celular Facultad de Ciencias de la Salud Universidad de Talca Julio 2005."— Transcripción de la presentación:

1 Dr. Jaime Rodríguez Laboratorio de cultivo celular Facultad de Ciencias de la Salud Universidad de Talca Julio 2005

2 Activación del endotelio por citoquinas proinflamatorias: TNF (factor  necrosis tumoral) IL-1 (interleuquina 1) Expresión de moléculas de adhesión ICAM-1, VCAM-1, E-selectina Expresión de moléculas de atracción química MCP-1 (proteína-1 de quimioatracción de monocitos)

3 NF-κB AMs

4

5

6 Marcadores biohumorales de activación endotelial: Moléculas de adhesión (Ams): ICAM-1 (molécula 1 de adhesión intercelular) VCAM-1 (molécula 1 de adhesión celular vascular) E-selectina

7 La acción de TNF e IL-1 es mediada por las MAPKs (proteina-quinasas activadas por mitógenos): 1.JNK (quinasa aminoterminal Jun) 2.p38

8

9 La deformación del endotelio provocada por el flujo sanguíneo es una importante fuerza ateroprotectora. Activación de la MAPKs: ERK 1/2 (quinasas relacionadas con señales extracelulares BMK 1 (MAPK 1 grande) Síntesis de NO

10 NO inhibe la expresión de moléculas de adhesión (Ams) por inhibición de NF-κB (factor nuclear kappa B). NF- κB cuando transloca al núcleo activa genes: citoquinas, Ams, ciclooxigenasa, Nos. ERK 1/2 inhibe la actividad de JNK, promueve la expresión de NOs (sintetasa del oxido nítrico). BMK 1 antagoniza efectos de JNK y p38 (mecanismo en estudio).

11

12

13

14 AISLAMIENTO DE CELULAS ENDOTELIALES DE VENA UMBILICAL HUMANA Retirar un segmento de vena umbilical y mantenerlo a 4 °C, hasta 1 hora en buffer Canular y perfundir con buffer (lavado) Llenar el trozo de vena con solución 0,2 % colagenasa y ligar en ambos extremos Incubar en buffer a 37 °C, durante 15 min Lavar con buffer y recibir el contenido en tubo de centrífuga Sedimentar las células a 250 g por 10 min. Lavar y resuspender

15 Condiciones de cultivo: Medio 199, 20 % FCS, penicilina estreptomicina, 37 °C, 5 % CO 2 Rendimiento: 0,5-1,5 millones de células

16

17

18

19 OTRAS CELULAS ENDOTELIALES: HDMEC: Human dermal microvascular endothelial cells (Applied Cell Biology Research Institute, Kirkland, WA). PMVEC: Human pulmonary microvascular endothelial cells (Applied Cell Biology Research Institute, Kirkland, WA).

20

21 Estudiar los efectos de pirrolidina ditiocarbamato (PDCT) y espermina NONOato (Sper-NO) sobre la expresión de moléculas de adhesión y la activación del factor nuclear kappa B (NF-κB) inducidas por TNF- en HDMEC. OBJETIVO PDCT: antioxidante, Sper-NO: donante de NO

22 EXPRESION DE MOLECULAS DE ADHESION TRATAMIENTO TNF 4 h

23 NAC (N-acetilcisteina): antioxidante. SNAP S-nitroso-N-acetilpenicilamina: donante de NO. EXPRESION DE MOLECULAS DE ADHESION TRATAMIENTO TNF 4 h

24 EXPRESION DE MOLECULAS DE ADHESION TRATAMIENTO TNF 8 h

25 EXPRESION DE mRNA de MOLECULAS DE ADHESION TRATAMIENTO TNF 2 h

26 NAC (N-acetilcisteina): antioxidante. SNAP S-nitroso-N-acetilpenicilamina: donante de NO. EXPRESION DE mRNA de MOLECULAS DE ADHESION TRATAMIENTO TNF 2 h

27 TRANSLOCACION NUCLEAR DE NF-Κb p65 ControlTNF PDCT+TNF Sper-NO+TNF

28 RAZON NUCLEO/CITOPLASMA DE NF-Κb p65

29

30 Estudiar el efecto de concentraciones de glucosa estable “normal” (5 mM), estable alta (20 mM) e intermitente (20/5 mM), sobre la producción de ICAM-1, VCAM-1 y E-selectina, así como la actividad de PKC y la expresión de las isoformas de PKC βI, βII y  en HUVEC. OBJETIVO

31 ACTIVIDAD PKC A LOS 14 DIAS DE TRATAMIENTO LY379196: inhibitor of PKC β, BIMI-I: PKC inhibitor, TTFA: inhibitor of mitochondrial complex II, MnTBAP: SOD mimetic, Mannitol: osmotic control.

32 EXPRESION DE PKC β1

33 EXPRESION DE PKC β2

34 EXPRESION DE PKC

35 CONTENIDO DE ICAM-1 EN EL SOBRENADANTE

36 CONTENIDO DE VCAM-1 EN EL SOBRENADANTE

37 CONTENIDO DE E-SELECTINA EN EL SOBRENADANTE

38 EXPRESION DE mRNA ICAM-1

39 EXPRESION DE mRNA VCAM-1

40 EXPRESION DE mRNA E-SELECTINA

41 8-Hydroxydeoxyguanosine (8-OHdG): a sensitive indicator of oxidative damage to DNA. DAÑO OXIDATIVO DEL DNA LY379196: inhibitor of PKC β, BIMI-I: PKC inhibitor, TTFA: inhibitor of mitochondrial complex II, MnTBAP: SOD mimetic, Mannitol: osmotic control.