TECNICAS GENÉTICAS

Detección de microorganismos directamente en muestras clínicas identificando un fragmento específico del genoma del microorganismo concreto Identificación del microorganismo tras su aislamiento por métodos convencionales Cuantificación del número de virus presentes en una muestra de sangre o suero (carga vírica) Detección de factores de virulencia Determinación de resistencia a antibióticos directamente en muestra o sobre cultivo Estudios epidemiológicos: comparación cepas aisladas

TÉCNICAS Muchas. Variantes de las preexistentes o nuevas Clasificación: Técnicas de hibridación Técnicas de amplificación

PREMISAS Primer paso: extracción de los ácidos nucleicos Métodos Lisis celular Concentración del ácido nucleico Protección frente a la degradación enzimática Eliminación de inhibidores de las reacciones que se vayan a realizar Métodos Físicos: sonicación, congelación/descongelación… Químicos: Proteinasa K + Fenol-cloroformo, Tiocianado de guanidina… Enzimáticos: lisozima…

PREMISAS Desnaturalización: cuando se calienta ADN por enciam de 90ºC las 2 cadenas se separan. Al descender la temperatura las basses vuelven a aparearse reconstituyendo el ADN original Sonda: pequeños fragmentos de ADN (20-50 nucleotidos) sintetizados en el laboratorio y cuya secuencia es complementaria de la de un fragmento genético, en este caso el que queremos detectar

HIBRIDACIÓN Unión de la sonda con su secuencia complementaria. Muy específica Detección: sondas marcadas Sustancia radiactiva Fluorescente Enzima Acs marcadas frente a ADN bicatenario …

HIBRIDACIÓN

Formatos HIBRIDACIÓN En solución Soporte o fase sólida In situ INNO-LIPA In situ

HIBRIDACIÓN

HIBRIDACIÓN ADN complementario Sonda Soporte Hibridación Sustrato Sustrato coloreado

TECNOLOGÍA DE LOS CHIPS O DE LOS “ARRAYS”

TÉCNICAS DE AMPLIFICACIÓN

TÉCNICAS DE AMPLIFICACIÓN Hibridación directa: baja sensibilidad Paso previo: amplificación Clonación in vitro que permite obtener múltiples copias de un fragmento de: ADN ARN: tras conversión en ADN complementario (ADNc) mediante un transcriptasa inversa

TÉCNICAS PCR Nested-PCR PCR múltiple PCR cuantitativa PCR a tiempo real Amplificación basada en la transcripción Otras técnicas que no amplifican una secuencia diana

PCR Se amplifica una secuencia diana espedífica de un microorganismo concreto utilizando una polimerasa y cambios de temperatura

REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR) Elementos químicos ADN problema Primers o iniciadores dNTPs Polimerasa Iones.... Elementos físicos Temperatura Desnaturalixación Apareamiento Síntesis o extensión ADN? Iniciadores Polimerasa dNTPs Iones...

Desnaturalización Apareamiento Extensión

NESTED-PCR Amplificación de un fragmento Reamplificación de un fragmento interno con otros cebadores En 1 tubo (diferentes temperaturas) o en 2 tubos

PCR MÚLTIPLE Muestra extraida + varios juegos de cebadores Amplificación de diferentes dianas Ej.: identificación + determinantes de resistencia

PCR CUANTITATIVA Determinar el número de copias de la muestra inicial Suele utilizarse una técnica competitiva Cantidad conocida ADN ó ARN problema ADN ó ARN competidor + Mismos cebadores Igual longitud amplificados Mismas condiciones Cantidad Cantidad Ci Ci = Relación lineal Cf Cf

PCR A TIEMPO REAL Realización en muy poco tiempo (aprox. 30´) Cuantificación continua y precisa del ADN que se va formando Igual que PCR convencional pero modificaciones técnicas Capilar: cambios de temperatura muy rápidos Fragméntos amplificados muy cortos Termociclador y lector específicos Diferentes métodos de detección

AMPLIFICACIÓN BASADA EN LA TRANSCRIPCIÓN Variedades: NASBA, TMA, 3SR… OTRAS TÉCNICAS QUE NO AMPLIFICAN SECUENCIAS DIANA Amplificación de las sondas una vez que estas han hibridado con sus dianas LCR (Ligase Chain Reaction) Ligar y amplificar los cebadores Q-replicasa: no comercializada

REACCIONES ANTÍGENO/ANTICUERPO Estrategias de laboratorio que permiten detectar que una reacción Ag-Ac ha tenido lugar Base fundamental: especificidad de la reacción + Dco directo ? Conocido ? Conocido + Dco indirecto