Construcción de inmuno y genosensores electroquímicos sobre superficies nanoestructuradas para el diagnóstico de neumonía adquirida en la comunidad MEC-06-BIO C – CARACTERÍSTICAS Y PATÓGENOS CAUSALES DE LA NEUMONÍA ADQUIRIDA EN LA COMUNIDAD 2 - MÉTODOS ESTÁNDAR PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA NEUMONÍA 3 - NUEVOS MÉTODOS PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA NEUMONÍA 4 - ESTRATEGIAS PARA EL DISEÑO DE GENOSENSORES

CARACTERÍSTICAS DE LA NEUMONÍA ADQUIRIDA EN LA COMUNIDAD Función del ámbito de adquisición: - Adquiridas en la comunidad o extra-hospitalarias. - Neumonías hospitalarias o nosocomiales. Grave, alta mortalidad/morbilidad 5-15% Países industrializados y en desarrollo Grupos de riesgo: niños < 2 años adultos > 65 años inmunocomprometidos: sida, transplantados, etc. España 7-15 casos/año/1000 habitantes La neumonía, es la infección del parénquima pulmonar producida por un agente infeccioso. La puerta de entrada del agente infeccioso suele ser la vía aérea. Los síntomas característicos son tos, dolor torácico y fiebre.

PATÓGENOS CAUSALES DE LA NEUMONÍA ADQUIRIDA EN LA COMUNIDAD Streptococcus pneumoniae Mycoplasma pneumoniae Chlamydophila pneumoniae Legionella pneumophila Chlamydophila psittaci Coxiella burnetti Haemophilus influenzae Klebsiella pneumoniae Escherichia coli Pseudomonas aeruginosa Moraxella catarrhalis Staphylococcus aureus Anaerobios Influenza Virus Sincitial Respiratorio Adenovirus Citomegalovirus Pneumocystis jiroveci Histoplasma capsulatum Cryptococcus neoformans Coccidioides immitis Toxoplasma gondii Strongyloides stercoralis Áscaris VIRUS HONGOS PARÁSITOS BACTERIAS

Construcción de inmuno y genosensores electroquímicos sobre superficies nanoestructuradas para el diagnóstico de neumonía adquirida en la comunidad MEC-06-BIO C – DEFINICIÓN Y PATÓGENOS CAUSALES DE LA NEUMONÍA ADQUIRIDA EN LA COMUNIDAD 2 - MÉTODOS ESTÁNDAR PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA NEUMONÍA 3 - NUEVOS MÉTODOS PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA NEUMONÍA 4 - ESTRATEGIAS PARA EL DISEÑO DE GENOSENSORES

MÉTODOS ESTÁNDAR PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA NEUMONÍA Analítica sanguínea Cultivos de microbiológicos de esputo y sangre Rx de tórax Tomografía axial computarizada El diagnóstico de neumonía se fundamenta tanto en la clínica del paciente como en resultado de Rx

SÓLO SE CONOCE EL AGENTE ETIOLÓGICO EN EL 50% DE LOS CASOS DIAGNOSTICADOS COMO NEUMONÍA. Microorganismos “fastidiosos” Los pacientes ingresan con tratamiento antibiótico previo Las muestras son de baja calidad Los métodos actuales no son suficientemente sensibles MÉTODOS ESTÁNDAR PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA NEUMONÍA

Chlamydophila psittaci Coxiella burnetti Haemophilus influenzae Klebsiella pneumoniae Escherichia coli Pseudomonas aeruginosa Moraxella catarrhalis Staphylococcus aureus Anaerobios BACTERIAS Influenza Virus Sincitial Respiratorio Adenovirus Citomegalovirus Pneumocystis jiroveci Histoplasma capsulatum Cryptococcus neoformans Coccidioides immitis Toxoplasma gondii Strongyloides stercoralis Ascariasis VIRUS HONGOS PARÁSITOS Streptococcus pneumoniae Mycoplasma pneumoniae Chlamydophila pneumoniae Legionella pneumophila NEUMONÍA TÍPICA MÉTODOS ESTÁNDAR PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA NEUMONÍA NEUMONÍA ATÍPICA

MÉTODOS ESTÁNDAR PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA NEUMONÍA Streptococcus pneumoniae Chest x-ray Gram-positiva Cápsula polisacarídica - 90 serotipos Flora normal nasofaringe 20-40% niños portadores asintomáticos Bacteremia Existen 2 vacunas: 7-val y 23-val Cultivo “gold-standard” sensibilidad a optoquina  -hemolisis Test rápido de orina BINAX NOW STREPTOCOCCUS Inconvenientes: Inespecífico en niños

Legionella pneumophila MÉTODOS ESTÁNDAR PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA NEUMONÍA Gram-negativa flagelada Parásito intracelular facultativo 1976 “enfermedad del legionario” 90% L. pneumophila Legionella sp 70 especies Medio acuático o C 35 serotipos, 1,4 y 6, L. micdadei Cultivo “gold-standard” Esputos muestras respiratorias Crecimiento 3-10 días Test rápido de orina BINAX NOW LEGIONELLA Inconvenientes: Sólo detecta serotipo 1

Mycoplasma pneumoniae MÉTODOS ESTÁNDAR PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA NEUMONÍA Muy pequeña Carece de pared celular Resistente a penicilinas Se transmite por gotas respiratorias Mucosas del huésped Parásito obligado Lento, sin esputo Artritis reumatoide, SJS Tinción Gram esputo negativa Crecimiento negativo en agar sangre Seroconversión “gold-standard” 2-4 semanas Inmunoflorescencia Muestras respiratorias

Chlamydophila pneumoniae MÉTODOS ESTÁNDAR PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA NEUMONÍA Patógeno intracelular obligatorio ciclo de vida compleja 10% de las NAC 1 caso/1000 habitantes/año Crecimiento lento sobre monocapas de Hep-2 Seroconversión “gold-standard” 2-4 semanas Inmunoflorescencia Esputo Muestras respiratorias Rx y TAC tórax

Construcción de inmuno y genosensores electroquímicos sobre superficies nanoestructuradas para el diagnóstico de neumonía adquirida en la comunidad MEC-06-BIO C – DEFINICIÓN Y PATÓGENOS CAUSALES DE LA NEUMONÍA ADQUIRIDA EN LA COMUNIDAD 2 - MÉTODOS ESTÁNDAR PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA NEUMONÍA 3 - NUEVOS MÉTODOS PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA NEUMONÍA 4 - ESTRATEGIAS PARA EL DISEÑO DE GENOSENSORES

Rápidos, resolución en las primeras 24 h NUEVOS MÉTODOS PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA NEUMONÍA Fácil manejo y bajo coste Sensibles y fiables Múltiples muestras Muestras no invasivas

PCR: Polymerase Chain Reaction NUEVOS MÉTODOS PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA NEUMONÍA Streptococcus pneumoniae Legionella pneumophila Mycoplasma pneumoniae Chlamydophila pneumoniae Haemophilus influenzae Streptococcus pyogenes lytA gene mip gene 16S rRNA Patógenogen Ventajas: sensible, rápida, relativamente asequible Inconvenientes: falsos positivos y falsos negativos Limitada a un número de patógenos PCR Convencional Real-time PCR PCR Simple “nested” PCR PCR múltiple

NUEVOS MÉTODOS PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA NEUMONÍA Multiplex PCR-Enzyme Hybridization Assay Chlamydophila pneumoniae Mycoplasma pneumoniae Legionella pneumophila Legionella sp omp-2 cytadhesin P1 23S-5S rRNA Patógenogen 23S-5S rRNA Chlamylege kit Ventajas: sensible, rápida, relativamente asequible Inconvenientes: Limitada a un número de patógenos

NUEVOS MÉTODOS PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA NEUMONÍA REAL-TIME MULTIPLEX PCR-ENZYME HYBRIDIZATION ASSAY Bordetella pertussis 2 CFU/ml Legionella pneumophila (serotypes 1 to 15) 9 CFU/ml Legionella micdadei 80 CFU/ml Mycoplasma pneumoniae 5 CFU/ml Chlamydophila pneumoniae % tissue culture infective doses Ventajas: sensible, rápida, relativamente asequible Inconvenientes: falsos positivos y falsos negativos Limitada a un número de patógenos

NUEVOS MÉTODOS PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA NEUMONÍA Detección directa de DNA/RNA Greene chip System Researchers Develop “GreeneChip” System First Infectious Disease Diagnostic Tool to Rapidly Detect and Identify Any Virus, Bacterium, Fungus, or Parasite. 29,495 probes 11,479 16S rRNA bacterial probes 1,120 18S rRNA fungal probes S rRNA parasite probes 300 host immune response probes Ventajas: amplio rango de patógenos Inconvenientes: difícil implantación

DNA SENSORS Patógenos: Escherichia coli Proteus mirabilis Pseudomonas aeruginosa Enterocococcus spp Klebsiella-Enterobacter Gen: 16S rRNA Ventajas: sin amplificación, resolución 45min Inconvenientes: necesita mejorar en sensibilidad NUEVOS MÉTODOS PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA NEUMONÍA

Construcción de inmuno y genosensores electroquímicos sobre superficies nanoestructuradas para el diagnóstico de neumonía adquirida en la comunidad MEC-06-BIO C – DEFINICIÓN Y PATÓGENOS CAUSALES DE LA NEUMONÍA ADQUIRIDA EN LA COMUNIDAD 2 - MÉTODOS ESTÁNDAR PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA NEUMONÍA 3 - NUEVOS MÉTODOS PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA NEUMONÍA 4 - ESTRATEGIAS PARA EL DISEÑO DE GENOSENSORES

GENES EXCLUSIVOS DE ESPECIE: ply, omp, etc Necesitan PCR múltiple Limita el nº patógenos Difícil PCR asimétrico Inconvenientes Ventajas Más específico GENES NO EXCLUSIVOS DE ESPECIE: 16S RNA Ventajas InconvenientesMenos específicos No necesitan PCR múltiple Aumenta el nº de patógenos Posible PCR asimétrico ESTRATEGIAS PARA EL DISEÑO DE GENOSENSORES copias de rRNA por célula

Alineamiento de 16S rRNA V6

Región V6 de 16S rRNA 5´GACGACAACCATGCACCACCTGT3` 23mer 124 pb ESTRATEGIAS PARA EL DISEÑO DE GENOSENSORES 5′ TCGATGCAACGCGAAGAACCTTCC`3 24mer

Streptococcus pneumoniae Streptococcus oralis Streptococcus mitis Streptococcus sanguis Mycoplasma pneumoniae Mycoplasma genitalium Legionella pneumophila Chlamydophila pneumoniae Legionella waltersii Legionella jordanis Legionella anisa Legionella longbeachae Legionella dumoffii Legionella parisiensis Legionella steigerwaltii Legionella cherrii Legionella brunensis Legionella wadsworthii Legionella quateirensis Legionella tucsonensis Legionella bozemanii ambientales flora Chlamydophila psittaci Chlamydophila abortus Chlamydia pecorum Chlamydophila caviae animales ESTRATEGIAS PARA EL DISEÑO DE GENOSENSORES Potencial interferencia de las sondas con otros microorganismos