Precolumna, columnas, tipos de relleno y marcas HPLC Precolumna, columnas, tipos de relleno y marcas DOCENTE: MTRO. FRANCISCO LÓPEZ NARANJO ESTUDIANTES : JOSÉ ERNESTO CABALLERO ZEPEDA JORGE ANTONIO JUÁREZ ALVAREZ CARLOS ALFONSO RIVAS SALAS MIGUEL ANGEL BRITO CORNEJO

Introducción La Cromatografía de Líquidos de Alta Eficiencia (HPLC) es la técnica con mayor mercado en el mundo instrumental analítico gracias a su versatilidad, excelente capacidad para el análisis de trazas, rapidez y adaptabilidad. La (HPLC) es una técnica de separación muy usual para semivolátiles y no volátiles o para analitos que se descompongan por calentamiento. El éxito de la separación de cromatografía de líquidos requiere que los analitos de interés sean solubles en el disolvente seleccionado como fase móvil.

Componentes de HPLC Los componentes fundamentales de un cromatógrafo de líquidos de alta resolución son comúnmente los siguientes: • Bomba • Inyector/Automuestreador • Columna • Detector • Recipientes de disolventes • Disolventes • Desgasificador • Filtro (frit) • Precolumna • Válvula de drenado • Sistema de datos/Integrador • Todas estas partes pueden presentar problemas y requieren diagnosticarlos

SISTEMA CROMATOGRÁFICO FASE MÓVIL BOMBA INYECTOR COLUMNA DETECTOR SISTEMA DE DATOS

Precolumna Para aumentar la vida de la columna analítica Elimina la materia en suspensión y los contaminantes de los disolventes. La composición debe de ser semejante al de la columna analítica; sin embargo, el tamaño de partícula es por lo común mayor para minimizar la caída de presión. Actúan como un filtro, sí ésta, empieza a bloquearse (la presión aumentará, para mantener la misma velocidad de flujo, de ser necesario la precolumna puede ser removida, limpiarla y reempacarla

Eliminan materia en suspensión y componentes de la muestra que se unen irreversiblemente a la fase estacionaria. Deberán ser de composición similar a la columna analítica, ayudando al buen funcionamiento de la columna analítica, reemplazando la precolumna cuando se contamine

Guardacolumna Bomba Guarda Columna Inyector Fase móvil Columna Sistema de datos Detector 7

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Columnas cromatográficas

Clasificación por Características Grupo químico enlazado C18 C8 C4 CN Ph NH2 Si C18: Muy hidrofobica, estable y primer elección. C8: Menos hidrofobica, requiere menos solvente orgánico. CN: La menos hidrofobica, no muy estable. Ph: Para compuestos de mediana polaridad. Recomendada para aromáticos. C4: Recomendadas para análisis de proteinas. NH2: Recomendada para carbohidratos. Si: Adecuada para compuestos orgánicos de polaridad media 10

Clasificación por Características Grupo químico enlazado C18 C8 C4 CN Ph NH2 Si 11

Clasificación por Características Tamaño de partícula (y distribución) 10, 5, 3, 2 um:     Eficiencia y Presión en HPLC. 12

Columnas analíticas Longitud entre 5 y 30 cm. Se pueden alargar, si es necesario, acoplando dos o más columnas. Diámetro interno de 4 a 10mm. Tamaños de las partículas de los rellenos más comunes son 3, 5 y 10 µm. La más utilizada 25 cm de longitud y 4.6 mm de diámetro interno, y empaquetada con partículas de 5 µm. Estas columnas tienen de 40 000 a 60 000 platos/metro.

Columnas capilares o microcolumnas Las columnas capilares tienen un diámetro menor a 1 mm, y hay de tres tipos: Tubular abierto. Parcialmente empacadas. Fuertemente empacadas. Estas columnas permiten trabajar con volúmenes de muestra de nL, disminuyendo el flujo y el volumen de solvente usado. Las condiciones y la instrumentación deben ser miniaturizados, la relación de flujo puede ser difícil de reproducir, el gradiente de elución no es tan eficiente, y se debe tener mucho cuidado cuando se cargan volúmenes de muestra tan pequeños.

Columnas de microcalibre y de calibre estrecho Pequeños volúmenes de muestra. Diámetro de 1-2 mm. Como en las columnas capilares, los instrumentos deben ser modificados para acomodarse a la pequeña capacidad de estas columnas. Sin embargo, excepto la ventaja de la pequeña cantidad de muestra y de volumen de la fase móvil, no se ha notado un incremento en la sensibilidad a la cantidad de materia inyectada sin pérdida significativa en la resolución.

Columnas estándar Comúnmente usadas. Su tamaño más habitual es de 2,4 mm de diámetro y 250 mm de largo, con un tamaño de partícula de 5 μm de diámetro. Las partículas pueden ser de sílica o de otros polímeros especiales que les confiere resistencia a determinadas condiciones (pH extremos) y a su vez pueden ser de forma esférica o irregular. Las partículas son de naturaleza porosa a fin de aumentar mucho la superficie de interacción con los analitos, y dado que también influye en la separación, se tiene en cuenta el diámetro de poro. Poros de las partículas entre 100 y 300 Å.

Columnas rápidas Aumenta el número de muestras que se pueden procesar en un tiempo dado. Diseñadas para rebajar el tiempo sin llegar a significativas desviaciones en los resultados. Mismo diámetro interno pero más cortas 30 a 75mm. Empacadas con pequeñas partículas de 3 μm de diámetro. 100000 platos/metro. Ventajas: Incremento de la sensibilidad. Descenso en el tiempo de análisis. Descenso en la fase móvil usada. Incremento en la reproducibilidad.

Columnas preparativas Son columnas utilizadas con el objeto de permitir purificar grandes cantidades de muestra (mg). Columnas con gran diámetro para facilitar grandes volúmenes de inyección.

Columnas para derivatizar Pre- o Post-columna separativa. Modifican químicamente el compuesto a una molécula con el que se van a obtener datos potencialmente tangibles que pueden complementar a otros resultados analizados anteriormente. Acetilación. Sililación. Hidrólisis ácida.

Relleno de las columnas Todas las separaciones por cromatografía tienen lugar sobre una fase estacionaria, las cuales están constituidas generalmente por partículas de materiales rígidos o semirrígidos, generalmente se utiliza sílice o polímeros sintéticos.

Además de su gran inercia química las modificaciones técnicas como, los poros, la granulometría, la forma e inclusive modificaciones químicas en su superficie, han permitido que el sílice sea el relleno mas utilizado en las columnas empleadas en cromatografía de líquidos, desplazando a los polímeros sintéticos.

Propiedades del sílice Tienen gran resistencia mecánica. Posee una amplia gama de formas, tamaños y diámetros de poro. Gran variedad de sílice respecto a su superficie.

Tamaño de partícula El tamaño de partícula esta estrechamente relacionado con la calidad y eficacia de la columna. La altura del plato teórico va en función del diámetro de la partícula. A menor TP se obtiene una menor altura del plato teórico y por lo tanto una mayor eficiencia. Además de obtener bandas mas estrechas y mas altas

Inicialmente se utilizaban partículas grandes (40 μm) lo que le confiere a la columna una gran capacidad de carga de la muestra, sin embargo daban a lugar bandas anchas, para solucionar esto se comenzó a utilizar películas formadas por capas de fase estacionaria, lo que daba origen a bandas mas estrechas.

Porosidad La porosidad se refiere a la capacidad de un material de absorber líquidos o gases o bien puede referirse al tamaño de los poros de una superficie semipermeable o un filtro. Los poros se clasifican de acuerdo a su tamaño siendo: Macroporo: > 50 nm Mesoporo: 2 – 50 nm Microporo: < 2 nm

Se utilizan con frecuencia para separaciones donde se necesita una selectividad alternativa, Especialmente cuando los analitos de interés contienen un anillo aromático

Bonna-Agela’s Durashell column Tiene un rango de pH de 1.5-12.0 , la tecnología usada en estas Columnas ofrece una fuerte capa de protección sobre la silica Permitiendo que la columna sea usada a pH extremadamente Bajos o altos. Las fases estacionarias incluyen C18,C8, Fenil y NH2

ACE® Equivalence™ C18 HPLC Columns, Hichrom Columna equivalente con especificaciones, calidad y buen costo, Compatible con varias marcas, pH recomendado 2-8