Dolores Miramar y Lorena Monge Galindo Unidad de Genética y Unidad de Neuropediatría AVANCES GENÉTICOS EN EL DIAGNÓSTICO DE RETARDO MENTAL Y TRASTORNO DEL ESPECTRO AUTISTA

GENÉTICA RM-TEA El retraso mental (RM) y el trastorno del espectro autista (TEA) son motivos frecuentes de consulta en Neuropediatría. Se estima que existe una prevalencia en la población de RM entre 1-10% y entre el 50-80% quedan sin diagnostico etiológico. Diagnóstico etiológico en TEA <10%. Prevalencia TEA “criptogénico” 3-6/1.000 Eirís-Puñal J, Gómez-Lado C, Castro-Gago M. ¿Hasta dónde con los estudios genéticos en neurología pediátrica? Rev Neurol 2008; 47: S65-73 Rauch A, Hoyer J, Guth S, Zweier C, Kraus C, Becker C, et al. Diagnostic yield of various genetic approaches in patients with unexplained developmental delay or mental retardation. Am J Med Genet A 2006; 140: 2063-74. Muhle R, Trentacoste SV, Rapin I. The genetics of autism. Pediatrics 2004; 113: 472-86.

ESTRATEGIA DIAGNÓSTICA INICIAL RM-TEA Hª Clínica – Exploración – Fenotipo característicos de síndrome concreto Prueba diagnóstica específica Hª Clínica – Exploración – Fenotipo inespecíficos - EEG - PEAT - PES 208* (estudio neurometabólico avanzado) - CARIOTIPO +/- FRAXA +/- DELECCIONES SUBTELOMÉRICAS Desde Sept 2009 Array-CGH * Sangre:glucosa, urea, creatinina, ác.úrico, iones, colesterol,triglicéridos, albúmina, perfil hepático, eq. ácido-base, amonio, láctico, Aminoácidos, homocisteína, β-hidroxibutirato, acetoacetato, AGL, AGCML,cobre-ceruloplasmina, CDT. Orina:ácidos orgánicos y mucopolisacáridos

GENÉTICA RM-TEA Anomalías detectadas por citogenética convencional son responsables de aprox 10% RM leve y 40% RM grave La aparación de nuevas técnicas moleculares (como arrayCGH) está aumentando el % de RM y TEA atribuido a causas genéticas, al ser capaces de detectar alteraciones cromosómicas “crípticas” Tasa diagnóstica del array-CGH para RM se encontraría en torno al 20%, una posible duplicación de la tasa previa a la aplicación de esta técnica. Shevell M, Ashwal S, Donley D, Flint J, Gingold M, Hirtz D, et al. Practice parameter: evaluation of the child with global developmental delay. Report of the Quality. Standards Subcommittee of the American Academy of Neurology and the Practice Committee of the Child Neurology Society. Neurology 2003; 60: 367-80. Moeschler JB. Medical genetics diagnostic evaluation of the child with global developmental delay or intellectual disability. Curr Opin Neurol 2008; 21: 117-22. Stankiewicz P, Beaudet AL. Use of array CGH in the evaluation of dysmorphology, malformations, developmental delay, and idiopathic mental retardation. Curr Opin Genet Dev 2007; 17: 182-92.

GENÉTICA RM-TEA Scherer et al. Nature genetics. 2007. 39; S7-S15.

GENÉTICA RM-TEA ¿Qúe es un microarray? Es un formato experimental Basado en la síntesis o fijación de sondas, para el análisis de genes, proteínas, tejidos, metabolitos.. Sobre un sustrato sólido (cristal, plástico, sílice..)

GENÉTICA RM-TEA ¿Cómo funciona un microarray? Nivel de hibridación entre la sonda específia (probe) y la molécula diana (target) Se cuantifica generalmente mediante fluorescencia Se analiza mediante análisis de imagen y algoritmos estadísticos.

GENÉTICA RM-TEA aCGH (array Comparative Genomic Hybridization) o cariotipo molecular analiza variaciones genómicas del número de copia de la totalidad del genoma a alta resolución. Las sondas depositadas sobre el cristal son fragmentos de ADN humano de distinto origen: - fragmentos clonados (BACs) - obtenidos por síntesis química: oligonucleótidos (25-85pb). La resolución viene dada en función del tamaño de la sonda y de la distancia entre ellas. El uso de oligonucleótidos en comparación con BACs permite: - examinar aberraciones cromosómicas por debajo del tamaño del BAC - mayor resolución - mejor relación señal-ruido

GENÉTICA RM-TEA ESQUEMA DE LA TECNICA CGH ARRAY Hibridación Mezcla Control marcado Cy3 Muestra marcada Cy5 Digestión Muestra Control

GENÉTICA RM-TEA El análisis de realiza mediante un software específico. Cuantifica el cambio en la señal de intensidad de cada sonda y obtenemos un valor relativo de cambio de intensidad de señal en escala 2-logarítmica: (log2ratio), en números que oscilan normalmente entre -4 y 4.

Ventajas y limitaciones del uso del aCGH GENÉTICA RM-TEA Ventajas y limitaciones del uso del aCGH Ventajas Automatizado, robusto, reproducible No requiere cultivo celular 1 microgramo ADN/ensayo Permite analizar todo el genoma Mayor resolucion Limitaciones Reordenamientos balanceados: Translocaciones recíprocas e inversiones Sólo detecta alteraciones del número de copia relativas al número de copia global (no poliploidías) Son caros y detectan alteraciones de significado incierto (CNVs) No detecta mosaicismos por debajo del 20%.

GENÉTICA RM-TEA Cariotipo > 10Mb CGH > 2 Mb FISH (interfase)  20 kb (sonda específica) FISH (metafase)  100 kb (sonda específica) aCGH (BACs) 100 kb. Resolución del array según nº y distribución de los BACs aCGH (oligonucleótidos) 0.06 kb. Resolución del array según nº y distribución de los oligonucleótidos

GENÉTICA RM-TEA Una alteración detectada por CGH array se debe validar mediante otros análisis genéticos: FISH MLPA (Multiplex Ligation Dependent Probe Amplification) Estudio de microsatélites En todos los casos se analizan las muestras parentales para determinar si la alteración encontrada es de novo o heredada y ofrecer asesoramiento genético a la familia. El análisis en muestras parentales tambien sirve para determinar la patogenicidad de la alteración encontrada

GENÉTICA RM-TEA Bases de datos Center for Information Biology Gene Expression Database (CIBEX) http://cibex.nig.ac.jp/index.jsp Coriell Cell Repositories NIGMS Human Genetic Cell Repository http://locus.umdnj.edu/nigms/ Database of Chromosomal Imbalance and Phenotypes in Humans using Ensembl Resources (DECIPHER) http://www.sanger.ac.uk/PostGenomics/decipher/ Database of Genomic Variants http://projects.tcag.ca/variation/ Ensembl http://www.ensembl.org Gene Expression Omnibus (GEO) http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/ Human Gene Nomenclature Committee (HGNC) Database http://www.gene.ucl.ac.uk/nomenclature/ Human Segmental Duplication Database http://projects.tcag.ca/humandup/ Human Structural Variation Database http://humanparalogy.gs.washington.edu/structuralvariation/ NCBI Single Nucleotide Polymorphism Database (dbSNP) http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/ Segmental Duplication Database http://humanparalogy.gs.washington.edu UCSC Genome Browser http://genome.ucsc.edu/

GENÉTICA RM-TEA Se realizó array-CGH en la consulta de Neuropediatría en: Clínica RPM-RM y/o Autismo + Fenotipo peculiar (no sind característico) Desde Septiembre 2009 a Febrero 2010: 104 extracciones Hasta el momento resultado en 92 casos: 62 normales 19 alterados 11 dudosos 20.65% alterados

CASOS CLÍNICOS

CASO 1 Controlado en la consulta desde 2002, a los 2 años por retraso psicomotor y microcefalia. Prematuro de 34 sem y CIR 1165g. Apgar 9/10 No datos de sufrimiento perinatal. Padres sanos no consanguíneos Inicio marcha a los 2 años Peso<P3, Talla P10, PC<P3 Fenotipo peculiar RM (Educación especial) y TDAH sintomático (tto metilfenidato). PES 208 + EEG + PEAT+ FO+ RM

CASO 1 ESTUDIO GENETICO Cariotipo+FRAXA+ deleciones subteloméricas Array CGH (17/11/2010) a los 8 años de edad: Deleción 1q21.1 Validación: MLPA de microdeleciones. Estudio padres: NORMAL ESTUDIO GENETICO arr1q21.1(144,940,640-146,290,972)x1. Monosomía segmentaria de 1.35Mb localizada en el brazo largo del cromosoma 1. Altera la dosis de más de una decena de genes, algunos de ellos descritos en OMIM. Esta deleción ha sido descrita anteriormente como causa de patología. La microdeleción de 1q21.1 se caracteriza por presentar un fenotipo variable, incluyendo retraso mental de leve a moderado, microcefalia, anomalías cardiacas y cataratas. Esta microdeleción, también se ha reportado asociada a esquizofrenia.

CASO 1 FOTO NIÑO

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CASO 2 Controlado desde los 6 meses (2000) por retraso psicomotor Prematuro de 37 sem y CIR 1750. Apgar 9/10 No datos de sufrimiento perinatal. Padres sanos no consanguíneos Ingresado en neonatal por CIR, tapón meconial, criptorquidia bilat, CIA y fenotipo con retromicrognatia e hipertrofia gingival. A los 8 meses ingresó en UCIP por shock séptico. En marzo de 01 presentó una convulsión en el contexto de un proceso febril.

CASO 2 ACTUALMENTE (11 años): Pobre contacto social, sin lenguaje expresivo y con escasa comprensión. Come todo triturado. Mantiene sedestación, no bipedestación. Fenotipo: boca en carpa, pequeña, y pelo claro rizado. Desviación cubital de 2º y 4º dedos de la mano, con pobre manipulación.Frecuentes estereotipias de manos y cefálicas. FENOTIPO PECULIAR (microcefalia) PCI HIPOTÓNICA RETRASO MENTAL RASGOS AUTISTAS

CASO 2 FOTO NIÑO

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CASO 2: EX. COMPLEMENTARIOS PES 208 + Serologías TORCH+EEG + FO+ RM (adelgazamiento CC) ENG/EMG

CASO 2: ESTUDIO GENETICO Cariotipo: AMPLIFICACION SRY (+) FRAXA Prader Willi-Angelman (2004)+ Steinert Delecciones subteloméricas (Abril 2009) BIOPSIA MUSCULAR: DNA mitocondrial/cadena resp Array CGH (Noviembre 2009): Disomía segmentaria del segmento distal del Xq + Nulisomía segmentaria de 40 Mb en Yq

CASO 2: ESTUDIO GENETICO arr Xq27.3q28(142,643,856-154,582,614)x2; arr Yq11.221-q12(17,057,224-57,432,779)x0 El cariotipo molecular del paciente revela una duplicación segmentaria de cerca de 12Mb de la porción distal del brazo largo del cromosoma X en la región q27.3-q28. Afecta cerca de un centenar de genes, un buen número de los cuales, como MECP2, L1CAM, FLNA o GDI1, han sido descritos en la literatura como causantes de retraso mental ligado al cromosoma X. La deleción de 40,3Mb causa una nulisomía para una gran parte del brazo largo cromosoma Y, con punto de fractura a nivel de q11.2-q12, afectando un gran número de genes.

CASO 2: ESTUDIO GENETICO

RETRASO PONDEROESTATURAL mantenido CASO 3 Controlada desde los 12 meses (2002) por retraso psicomotor Prematura de 35 sem, 2ª gemela. CIR 1750. Apgar 9/10 Padres sanos no consanguíneos Actualmente (10 años): FENOTIPO PECULIAR (microcefalia) RETRASO MENTAL RETRASO PONDEROESTATURAL mantenido CIA pendiente de IQ PES 203 + EEG + TAC

CASO 3 Cariotipo+FRAXA+ delecciones subteloméricas Array CGH (Octubre 2009) a los 8 años de edad: arr 17p11.2(16,698,089-20,160,197)x3. Duplicación intersticial de 3,46Mb de material procedente del brazo corto del cromosoma 17. Se corresponde con la duplicación recíproca del síndrome de Smith-Magenis, causante de un cuadro de genes contiguos denominado síndrome de Potocki-Lupski (PTLS - OMIM #610883). Los pacientes con esta duplicación a menudo presentan un tono muscular pobre, dificultad para alimentarse, y un retraso en el desarrollo tanto motor como psicológico durante la infancia. Además, pueden presentar características de comportamiento similares a las personas autistas o con trastornos del espectro autista, pueden tener defectos cardiacos y apneas en el sueño. Los rasgos dismórficos son compartidos entre los pacientes pero no son especialmente destacables por lo que pueden pasar desapercibidos.

Validado mediante MLPA DE MICRODELECIONES CASO 3 Validado mediante MLPA DE MICRODELECIONES Estudio en los padres: NORMAL. Alteración “de novo”

CASO 3 FOTO NIÑA

CASO 3 FOTO NIÑA

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CASO 3 FOTO NIÑA

CASO 4 Controlado desde los 13 meses (2007) por retraso psicomotor Parto a las 39 sem y PRN 3040. Apgar 9/10 No datos de sufrimiento perinatal. Padres sanos no consanguíneos Procedente de Rumania de donde adjuntan TAC: Discreta dilatación de VVLL y III V. FOTO TAC FOTO TAC

TRASTORMO ESPECTRO AUTISTA CASO 4 Actualmente (5 años): FENOTIPO PECULIAR (microcefalia) TRASTORMO ESPECTRO AUTISTA ESTRABISMO FOTO NIÑO FOTO NIÑO

CASO 4 FOTO NIÑO FOTO NIÑO PES 208 + EEG + PEAT

CASO 4 Cariotipo. Array CGH (Agosto 2010) a los 4 años de edad: Deleción 17p11.2 - síndrome de Smith-Magenis (OMIM 182290) arr17p11.2(16,947,482-20,160,197)x1. Deleción intersticial de 3.2Mb en la banda 17p11.2, coincidente con la deleción típica causante del síndrome de Smith-Magenis. Altera la dosis de unos cuantos genes de OMIM, entre ellos RAI1 (OMIM 607642). Esta deleción se ha descrito previamente en asociación a retraso mental, problemas de comportamiento, anomalías craneofaciales y esqueléticas, retraso del desarrollo y del habla y alteraciones del sueño

CASO 4 Validación mediante MLPA de microdeleciones: Estudio en los padres: NORMAL. Alteración “de novo”

CASO 5 Controlada desde los 9 meses (2010) por retraso psicomotor Parto a las 42 sem y PRN 3200 Apgar 9/10 No datos de sufrimiento perinatal. Padres sanos no consanguíneos Amniocentesis normal FENOTIPO PECULIAR (Macrocefalia) RETRASO MENTAL ESTRABISMO

CASO 5 RM craneal y medular FOTO TAC FOTO TAC

CASO 5 FOTO TAC FOTO TAC

CASO 5 Cariotipo y FRAXA normales MLPA de Deleciones subtelomericas, MLPA de microdeleciones y MLPA región 22q13: Deleción en 22q13, compatible con el síndrome de Phelan McDermid. Muestras parentales NORMALES MLPA deleciones subtelomericas: delecion en 22q MLPA de microdeleciones: delecion en 22q13 MLPA de region 22q13: delecion en 22q13 que incluye a los genes GTSE1, ALG12, MLC1, PLXNB2, SBF1, ECGF1, CPT1B, MAPK8IP2, ARSA, SHANK3, ACR y RABL2B. Probablemente hasta 22qter.

CASO 5 Array CGH (febrero 2011) a los 22 meses: Deleción en 22q13, compatible con el síndrome de Phelan McDermid arr 22q13.31q13.33(44,840,049-49,566,016)x1. Monosomía segmentaria de 4.7Mb en el brazo largo del cromosoma 22, afectando a las bandas q13.31-q13.33, que altera la dosis de más de cincuenta genes RefSeq, algunos de ellos descritos en OMIM dada su asociación a patología. Esta deleción, solapa con una región de reordenamiento recurrente, previamente reportada en la literatura como síndrome de microdeleción 22q13, o Phelan-McDermid syndrome, el cual se caracteriza por la presencia de un retraso global del desarrollo, retraso severo o ausencia del lenguaje e hipotonia. El gen SHANK se considera el principal responsable de las características fenotípicas del síndrome, especialmente los síntomas neurológicos. Las proteínas codificadas SHANK juegan un rol importante en la maduración y estabilización de la sinapsis entre neuronas en el cerebro: proveen el soporte estructural para el ensamblaje de los receptores de glutamato con el aparato de señalización intracelular y el citoesqueleto en la densidad postsináptica.

CASO 5 PROBANDO PADRES

TDAH (tto metilfenidato) CASO 6 Controlada desde los 8 meses (2000) por RETRASO PSICOMOTOR y MACROCEFALIA Discreta dilatación de astas anteriores en EcoTF Parto a término 39 sem y Peso 3.230g. Apgar 10/10 No datos de sufrimiento perinatal. Padres sanos no consanguíneos ACTUALMENTE (7 años): FENOTIPO PECULIAR (Macrocefalia) RETRASO MENTAL TDAH (tto metilfenidato)

CASO 6 FOTO NIÑA

CASO 6 FOTO NIÑA

CASO 6: EX. COMPLEMENTARIOS PES 208 + EEG + PEAT Cariotipo + FRAXA + Steinert RM cerebral: discreto aumento VVLL (>Izq) + hiperintensidad periV predominio posterior.

CASO 6: ESTUDIOS GENETICOS Cariotipo + FRAXA + Steinert Subteloméricas (mayo 2010): Trisomía de la región subtelomérica 1q

CASO 6: ESTUDIOS GENETICOS Array CGH (abril 2010), a los 6,5 años: arr1q42.2q44(229,505,714-247,164,526)x3. Trisomía de 17.66Mb de material procedente del extremo más distal del brazo largo del cromosoma 1. Altera la dosis de más de cincuenta genes, muchos de ellos implicados en patología. Se han descrito con anterioridad casos en la literatura con ganancias de material que afectan regiones de tamaño parecido al identificado en esta paciente y existen manifestaciones fenotípicas comunes a ellos. arr7p22.3(141,377-323,057)x1. Monosomía segmentaria de 182Kb en el brazo corto del cromosoma 7.

CASO 6: ESTUDIOS GENETICOS Estudio FISH con sondas XCP Cr1 y XCP Cr7 PROBANDO

CASO 6 FOTO TAC

CASO 6 FOTO TAC

CASO 7 Controlada desde los 14 meses (1999), derivada por Maxilofacial por por RETRASO PSICOMOTOR + LABIO LEPORINO Parto a término 33 sem y Peso 2450g Apgar 9/9. No IOT Padres sanos no consanguíneos. Amniocentesis 2 días antes del parto al observarse labio leporino 2002 Educación especial 2004 Tricotilomanía y tricobezoar 2004 Episodios de mirada fija 8-10 seg EEG PO Temporo-rolándica bilateral (>Izq) Tto Oxcarbacepina

CASO 7 FOTO NIÑA FENOTIPO PECULIAR RETRASO MENTAL TRAST COMPORTAMENTAL (tto risperidona)

CASO 7 FOTO NIÑA PES 208 + PEAT + FO Cariotipo + Subteloméricas TAC y RM craneal FOTO NIÑA

CASO 7 Cariotipo + deleciones Subteloméricas: normales Array CGH (2010), a los 13 años: arr7q33q36.1(136,934,609-150,618,500)x1. Monosomía segmentaria de 13.7Mb en el brazo largo del cromosoma 7, afectando a las bandas cromosómicas q33-q36.1. Altera la dosis de más de un centenar de genes RefSeq, muchos de ellos implicados en patología según OMIM. Recientemente, se ha descrito una deleción coincidente con la identificada en este caso, aunque de menor tamaño (12Mb), en una mujer adulta con retraso mental, trastorno del espectro autista y amenorrea primaria

COMENTARIOS Rapidez con la que aparecen nuevas técnicas principalmente en el campo de la genética. Importancia del asesoramiento genético a la familia y asesoramiento genético reproductivo, con posibilidad de diagnóstico prenatal o preimplantacional. La técnica aCGH es muy útil para el diagnóstico genético de pacientes con retraso psicomotor y/o trastorno del espectro autista. Nuestra experiencia nos demuestra que no existe una única técnica que permita el análisis genético en estos casos. Todas las técnicas empleadas tienen sus ventajas y limitaciones. Importante adaptarse a los continuos avances y proceso de continua revisión y actualización de conocimientos. Importancia del seguimiento evolutivo de nuestros pacientes, revisión de los casos ante los datos evolutivos que presentan y las nuevas técnicas disponibles.