Laboratorio de Virología CULTIVOS CELULARES Gloria L. Camargo Laboratorio de Virología Universidad de Boyaca

Que son los cultivos celulares?... in vitro Mantenimiento o crecimiento Conjunto de técnicas Cell, tejidos u órganos (animal o vegetal) Cto, x.x, metabolismos Ambiente artificial propiedades Fisiológicas, bioquímicas, genéticas

APLICACIÓN... Aislamiento Amplificación Descubrimiento Hospedero Vacunas Rta inmunitaria Biología molecular Bioquímica

HISTORIA... 1866 1885 1907 1913 1932 1948 1949 Von Recklinghansen. Logro mantener vivos por mas de un mes hematies de anfibios 1885 Roux. Demostró la factibilidad de mantener cell vivas en medios artificiales 1907 Harrison. Estudio sistemático de los cultivos en cell in vitro 1913 Steinhadt. Virus de la viruela sobrevivía varias semanas en cultivos de tejidos de cornea de conejos y caballos 1932 Topacio y Hyde Los virus al multiplicarse producen cambios en los cultivos cell ECP 1948 Earle y col. Demostraron que para que una cell se divida necesita ser alimentada con los nutrientes correctos 1949 Enders y col. El virus de la poliomielitis puede propagarse en cultivos cell de origen diferente al tejido nerviosos

1952 Gry y col. Establecen la primera línea cell continua (HeLa). Medios con plasma de pollo, extracto SFB 1955 Se investiga los requerimientos nutritivos de las cell en cultivo. Suero, a.a, azucares. 1961 Hayflick y Moorhead Usaron por primera vez a/b para prevenir la contaminación de los cultivos de fibroblastos. Pudieron realizar 12 pases de los cultivos. 1969 Austi Tocco y Sato. Se empiezan a establecer las primeras líneas celulares diferenciadas 1979 Sato y col demuestran que las diferentes líneas celulares requieren mezclas distintas de hormonas y factores de crecimiento. Hoy Se realiza la vacuna para la Influenza A H1N1 en Cultivos Cell

CLASES DE CULTIVOS CELULARES... Extraer el órgano o tejido del organismo de origen Tienen diferentes clases de cultivo, que se caracteriza Capacidad de ser sub-cultivado Capacidad de replicacion Consiste en transferir células de un cultivo crecido a un nuevo recipiente, para que se genere otro cultivo. (PASE)

CULTIVOS EN MONOCAPA... Células adherentes o cultivos fijos Requieren unirse SUPERFICIE 2 TIPOS Dependientes de anclaje MULTIPLICARSE ESTACIONARIO AGITACIÓN

CULTIVOS EN SUSPENSIÓN ... Suspendidas Células se multiplican Medio liquido Subcultivo por dilución No adhesión Cultivo inicial adquirió máximo de saturación

CULTIVO PRIMARIO... MÁXIMO 10 SUBCULTIVOS. Células provenientes del tejido original Trasplantados a Condiciones artificiales Porción celular variada PROLIFERAR POBLACIÓN CELULAR PASES SUCESIVOS RÁPIDAMENTE LENTAMENTE PREDOMINA DESAPARECE MÁXIMO 10 SUBCULTIVOS.

LINEAS CELULARES... Derivadas de un cultivo primario, se pueden cultivar in vitro repetidamente y se dividen en : DIPLOIDE HETEROPLOIDES + 75% - 75% Mismo cariotipo de las células Se originan normales y siguen normales Mismo cariotipo de las células Se originan tejido normal o anormal Cell sufren transformaciones

VIRUS QUE PUEDEN SER AISLADOS EN CADA TIPO CELULAR LINEA CELULARES TEJIDO DE ORIGEN VIRUS QUE PUEDEN SER AISLADOS EN CADA TIPO CELULAR HEp-2 Carcinoma epidermoide de laringe humana Herpes simplex, Enterovirus, Poliovirus, Adenovirus. MDBK Riñón bovino Herpes y Adenovirus bovino, estomatitis vesicular. MDCK Riñón canino Influenza, Adenovirus MRC-5 Pulmón embrionario humano Citomegalovirus Vero Riñón de mono Herpes y Poliovirus BHK-21 Riñón de hamster Estomatitis vesicular y feibre aftosa HeLa Carcinoma de cervix humano Poliovis, Adenovurus RD Rhabdomiosarcoma humano Poliovirus, Herpes simplex PK 15 riñón porcino Estomatitis vesicular, Parvovirus porcino. A. albopictus Larva de Aedes albopictus Arbovirus.

MEDIOS DE CULTIVO... MEM Medio de crecimiento Medios selectivos mantenimiento Medios selectivos Medios de congelación Requerimiento Mínimo MEM MEM Tipo de células MEM SSB, a.a. vitaminas 10-15% 2% SFB Propósito del cultivo 50% SFB Base para los demás medios SFB Intervalo de subcultivos Crecimiento utilización 8% dimetil sulfoxido

Factores basicos para la supervivencia celular... Oxigeno Presión osmótica Agua pH SSB Vitaminas Suero A.A.

Obtención de las células..

Unión a colorantes acoplados a colorantes fluorescentes

MICRODISEPCIÓN POR CAPTURA DE LASER

Contenedores para cultivo celular A: Fraso T. B: Frasco triple. C: Botellas rodantes. D: Biorreactor. E: Frasco con pipetas. F: Frascos con agitación.

Contaminación de los cultivos cell... La contaminación puede tener varios origenes: Tejidos originales Productos biológicos (suero –mycoplasma R a penicilina) El personal del laboratorio con su propia flora Del medio ambiente (laboratorio- material)

Cuando esta presente en cultivos celulares, no siempre resulta en alteraciones microscópicas de las células o del medio; muchas infecciones crecen lentamente y pueden tener los siguientes efectos:

Niveles y normas de seguridad Nivel 1. No presentan peligros reconocidos. Nivel 2. Se emplean materiales de origen primario que no se conoce el riesgo de infección o que tienen la posibilidad de que en las muestras contengan VIH, TBC, hepatitis B u otros patógenos. Nivel 3. Su manejo presenta un riesgo potencial. Nivel 4. Extremadamente peligrosos.

Contaje celular... Porcentaje de viabilidad (%) = Número de células vivas/Número de células totales *100 (>85-90% se siembra). Número de células vivas/ml = Células contadas vivas x factor de dilución x 104 Número de células necesarias = Número de placas x la mitad del volumen de cada placa x células viables (1.350.000 para neuronas).

Ventajas...

CULTIVO DE CELULAS INFECTADA CON SARAMPION 7 DIAS POST INOCULACIÓN SE OBSERVAN CÉLULAS GIGANTES Y MULTINUCLEADAS (40X)

SE OBSERVAN INCITOS (AGRUPACIONES DE CÉLULAS) EN 100X

CÉLULAS VERO SIN INFECTAR 48 HORAS POS INFECCION.

CÉLULAS VERO SIN INFECTAR, SE OBSERVA BIEN DEFINIDO EL CITOPLASMA, LOS NUCLEOS CON SUSU RESPECTIVOS NUCLEOLOS.

CÉLULAS VERO 24 HORAS POS INFECCION

CELULAS DE HIGADO DE CONEJO TEÑIDAS CON GIMSA , 48 HORAS POS INFECCION (100X) NORMALES.

CÉLULAS DE HIGADO DE CONEJO SIN INFECTAR, SE OBSERVAN LOS NUCLEOLOS Y CITOPLASMA SINAFECTAR.

CÉLULAS GIGANTES POR EFECTO CITOPATICO ( CULTIVO DE CELULAS DE CONEJO) CAUSADO POR VIRUS DE Herpes zoster.

CÉLULAS DE HIGADO DE CONEJO INFECTADAS con virus Herpes Zoster.

INFECTADA Vs NO INFECTADA

Gracias…