Diagnóstico Referencial Enfermedad de Chagas Diagnóstico Referencial

Trypanosoma cruzi Hospedadores Protozoo, hemoflagelado Intermediario: Triatoma infestans Subfamilia: Triatominae Taxonomía Familia: Reduvidae Orden: Hemíptera Definitivo: Hombre y animales domésticos y selváticos Prevalencias América Latina: Vías de transmisión 100 millones en riesgo vectorial 16 a 18 millones infectados transfusional Argentina: vertical 2.300.000 infectados tx. órganos accidental

CARGA SOCIAL América Latina: 16 a 18 millones de infectados Cono Sur: 6.5 millones de infectados Mortalidad por año: 23.000 (Banco Mundial) 43.000 (OMS) AÑOS DE VIDA PERDIDOS POR INCAPACIDAD (AVADS) MAYOR CARGA DE ENFERMEDAD Respiratorias Agudas Diarreas Sida Enfermedad de Chagas

OBJETIVO DEL PROGRAMA TRATAMIENTO QUÍMICO CON INSECTICIDAS (MONODOSIS DE PIRETROIDES SINTÉTICOS CON ACCIÓN RESIDUAL) A TODAS LAS VIVIENDAS DE AREA ENDÉMICA. INSTALACIÓN DE LA VIGILANCIA CON PARTICIPACIÓN COMUNITARIA MEDIANTE MÚLTIPLES EFECTORES. DETECCIÓN DE INFECCIÓN CHAGÁSICA A TODOS LOS NIÑOS MENORES DE 15 AÑOS RESIDENTES EN AREAS DE VIGILANCIA. ATENCIÓN MÉDICA Y TRATAMIENTO SUPERVISADO DE LOS INFECTADOS CHAGÁSICOS. CONTROL DE LA MADRE CHAGÁSICA Y SU HIJO HASTA EL AÑO DE VIDA. CONTROL DE BANCOS DE SANGRE Y DE LOS LABORATORIOS (CONTROL DE CALIDAD EXTERNO). CONTROL DE DADORES Y RECEPTORES DE TRANSPLANTES DE ÓRGANOS.

N° de Muestras que Controlan N° de Muestras Reactivas PREVALENCIA DE INFECCIÓN POR TRIPANOSOMA CRUZI EN BANCOS DE SANGRE PÚBLICOS Y PRIVADOS ARGENTINA 2005-2007 AÑOS N° de Muestras que Controlan N° de Muestras Reactivas Prevalencia % 2005 432481 13761 3.18 2006 425489 13266 3.12 2007* 386989 12403 3.21 *Falta Incorporar datos de Santa Cruz Fuente: Centro Nacional Red de Laboratorios ANLIS - Malbrán

Modalidad evolutiva de la Enfermedad de Chagas con respecto al umbral clínico 95 - 99 %

Evolución serológica y parasitológica en pacientes infectados por T. cruzi

Diagnóstico de la infección por Trypanosoma cruzi Control y tratamiento de la enfermedad de Chagas (1) Medidas de control de la endemia Transmisión vectorial vigilancia entomológica Detección de la madre Chagásica y seguimiento del recién nacido Seguimiento serológico de los niños Control obligado de la sangre donada para transfusiones

Dupla Serológica

Normas de Diagnóstico para la infección de Chagas Métodos serológicos Métodos parasitológicos Chagas agudo X X Antes de 6 meses X Transmisión materno - infantil Después de 6 meses X X Chagas asintomático crónico X Control de los donantes de sangre y de la sangre a transfundir X Detección de la Infección en pacientes inmunosuprimidos Dador X Receptor X X HIV X X

CHAGAS-HIV Manifestaciones más graves y frecuentes en esta coinfección: 1-Compromiso SNC 2-Afecciones cardíacas Alta Morbimortalidad por reactivación de la infección chagásica favorecida por las diversas vías probables de contagio relacionadas con la “urbanización” de la enfermedad debido a la migración desde zonas endémicas hacia las grandes ciudades en busca de mejores condiciones de vida El seguimiento de estos pacientes debe hacerse con protocolo de monitoreo preestablecido utilizando métodos altamente sensibles que posibiliten la detección temprana de una reactivación de la infección implementando el tratamiento específico en forma rápida, evitando así el compromiso del SNC

Parásitos Anticuerpos Métodos Métodos Parasitológicos Métodos de Diagnóstico de Laboratorio Parásitos Anticuerpos Métodos Parasitológicos Métodos Inmunoserológicos

Métodos parasitológicos Demostración directa de parásitos Demostración indirecta de parásitos Amplificación

Métodos parasitológicos Demostración directa de parásitos S A N G R E T E J I D O S Concentración Micrométodos de capilares Micrométodo del INP Strout Gota Fresca 1. Biopsias de lesiones cutáneas 2. Biopsias de ganglio linfático 3.Necropsias

DE RISSIO AM, MAIDANA C, MARTIN GARCIA M Y RUIZ AM NUEVO MICROMETODO DE RISSIO AM, MAIDANA C, MARTIN GARCIA M Y RUIZ AM Medicina Vol 59 Supl III - 1999 Tubo Eppendorf de 1,5 ml de capacidad mezclar por inversión una gota de heparina + 0,5 ml de sangre venosa tomar un a gota de la interfase ( glóbulos blancos) centrifugar 1 minutos a 3000 rpm Colocar cubre objeto

Trypomastigotes metacíclicos Leer al microscopio con 400 aumentos durante 30 minutos cada preparado. Se debe realizar cuatro preparado por paciente.

Positivo Negativo Total 15 1 16 383 384 399 CORRELACIÓN ENTRE LOS RESULTADOS OBTENIDOS POR EL MICROMÉTODO Y EL XENODIAGNÓSTICO   Micrométodo Xenodiagnóstico Positivo Negativo Total 15 1 16 383 384 399 Concordancia entre ambos métodos: 99.7% Sensibilidad del Micrométodo: 94% Tasa de incidencia por Micrométodo: 3.8% Tasa de incidencia por Xenodiagnóstico: 4%

Strout 8-10 ml de sangre sin anticoagulante Dejar retraer el coágulo Centrifugar 3 minutos a 160 G (800 rpm) Centrifugar 5 minutos a 300-600 G (2000-2500 rpm) Se observa el sedimento entre porta y cubreobjeto en microscopio con 400x

PCR (Reacción en cadena Métodos parasitológicos Demostración indirecta de parásitos Amplificación PCR (Reacción en cadena por ADN polimerasa) Inoculación en animales sensibles Sangre con Guanidina Enriquecimiento Hemocultivo S: 99.7% < 20% Xenodiagnóstico S: 100% 45-50%

Reacción en Cadena por ADN Polimerasa PCR en la Enfermedad de Chagas Investigación a nivel molecular Aplicación en Enfermedad de Chagas Epidemiología: Identificación y caracterización de cepas Diagnóstico: Monitoreo en tratamientos antiparasitario Diagnóstico en pacientes inmunosuprimidos: SIDA, Transplantados y otros Diagnóstico perinatal Incrementar la sensibilidad de los métodos parasitológicos ya estandarizados

Estado Actual de Desarrollo de la PCR permite: Expectativas Reacción en Cadena por ADN Polimerasa PCR en la Enfermedad de Chagas Estado Actual de Desarrollo de la PCR permite: Confirma ausencia de infección Resultados rápidos Define casos Dudosos Expectativas Cuantificación de la parasitemia (PCR Real time) Pronóstico evolutivo de la infección por determinación directa de los clones infectantes

Ensayoinmunoenzimático Indirecta cuantitativa Indirecta cuantitativa Métodos serológicos Técnicas Ensayoinmunoenzimático Inmunofluorescencia Indirecta cuantitativa Aglutinación Aglutinación pasiva Aglutinación directa Hemoaglutinación Indirecta cuantitativa De partículas gelatina polimerizada

ANTIGENOS REACCIONES DE AGLUTINACION: Suspensión de formas epimastigotes de cultivo de T. cruzi Sobrenadante de un lisado crudo total de epimastigote de T. cruzi Péptidos de la secuencia antigénica del T. cruzi ENZIMOINMUNOENSAYO: Moléculas solubles obtenidas por ruptura de los parásitos enteros Purificados por distintos medios (anticuerpos monoclonales, fracciones celulares) Técnica de ADN recombinante a partir de proteínas específicas de los estadíos epimastigote y tripomastigote del T. cruzi INMUNOFLUORESCENCIA: Epimastigote de cultivo axénicos tratados con formol

Partículas de gelatina Ag de Trypanosoma cruzi inactivado + Ac Anti-T. cruzi AGLUTINACIÓN

Partículas Polimerizadas Péptidos de la secuencia antigénica del T. cruzi

Reacciones Serológicas Enzimoinmunoensayo Hemaglutinación Indirecta Inmunofluorescencia

Epimastigotes de Trypanosoma cruzi por Inmunofluorescencia

HAI-ELISA HAI-IFI ELISA-IFI Sensibilidad: 99,8% Duplas serológicas HAI-ELISA HAI-IFI ELISA-IFI Sensibilidad: 99,8%

Inmunodiagnóstico - Criterio de elección (Duplas serológicas) Banco de sangre ¨Screening¨ o ¨Descarte¨ Epidemiología Consulta clínica y/o cardiológica Embarazadas Grupo familiar Banco de sangre Politransfundidos Preocupacionales Migraciones Donantes y receptor de órganos ¨Confirmación¨

Control de los donantes de sangre y de la sangre a transfundir ¨Screening¨ o ¨Descarte¨ A aquellas reacciones que permiten identificar rápidamente los sueros reactivos y que ofrecen un margen de seguridad en la detección Métodos: HAI y ELISA (Títulos de corte correspondientes para screening o descarte según indique el productor del reactivo) -Todos los dadores de sangre deben ser estudiados serológicamente para Chagas. -Cuando se obtengan resultados reactivos por 1 o 2 métodos de descarte se deberá desechar la bolsa de sangre. -El Laboratorio que realice la selección o descarte de las muestras reactivas, debe derivar al dador encontrado reactivo al Laboratorio de Referencia para confirmar o descartar infección.

Análisis de los Resultados del Inmunodiagnóstico Pruebas Serológicas efectuadas: ELISA- HAI / ELISA-IFI / HAI-IFI Resultados: Reactivo ( con títulos obtenidos) o No Reactivo Interpretación de los Resultados: El Inmunodiagnóstico se considerará Reactivo cuando por lo menos dos pruebas serológicas son Reactivas.

Diagnóstico Referencial

Diagnóstico Referencial

Diagnóstico Referencial

Control de Calidad Informe de Resultados Totales país, 2006 24 Jurisdicciones del país, respondieron 23 Panel de 4 muestras de Suero Control liofilizado, 2 Reactivos (Alta y Baja reactividad) y 2 No Reactivos Instructivo Planilla para informe de resultados Se enviaron 506 Paneles de Control Se recibieron 396 respuestas (78%) Análisis de Resultados: Fueron agrupados por pruebas serológica empleada (Aglutinación y ELISA para T. cruzi) sin diferenciar marcas o lotes de equipos usados para las 4 muestras de control. Los resultados se expresan como N° de aciertos / N° de respuestas Fuente: Dra. Estela N. Cura, Centro Nacional de Control de Calidad de Biológicos- ANLIS “Dr. Carlos G. Malbrán”

Resultados del Control de Calidad Externo de la Red de Chagas, período 2006. Resultados obtenidos con pruebas de Aglutinación (diferentes marcas y lotes), por el conjunto de los Laboratorios Participantes. Muestra 1 (Suero Control No Reactivo) Muestra 2 Reactivo, alta reactividad) Muestra 3 baja reactividad) Muestra 4 N° de Aciertos / N° de respuestas 355 / 386 387 / 388 379 / 388 378 / 387 Concordancia de resultados ( % ) 92 100 98 Fuente: Dra. Estela N. Cura, Centro Nacional de Control de Calidad de Biológicos- ANLIS “Dr. Carlos G. Malbrán”

Resultados del Control de Calidad Externo de la Red de Chagas, período 2006. Resultados obtenidos con pruebas de ELISA (diferentes marcas y lotes), por el conjunto de los Laboratorios Participantes. Muestra 1 (Suero Control No Reactivo) Muestra 2 Reactivo, alta reactividad) Muestra 3 baja reactividad) Muestra 4 N° de Aciertos / N° de respuestas 348 / 351 353 / 353 351 / 354 Concordancia de resultados ( % ) 99 100 Fuente: Dra. Estela N. Cura, Centro Nacional de Control de Calidad de Biológicos- ANLIS “Dr. Carlos G. Malbrán”

Conclusiones Con las pruebas de Aglutinación se encontró mayor proporción de Falsos Positivos para muestras No Reactivas (92 y 98%) que con pruebas de ELISA (99%). Los Falsos Negativos hallados con el suero Reactivo con baja reactividad fue del 2% para pruebas de Aglutinación y del 1% para ELISA. Esto aporta justificación al empleo de la dupla serológica según Normas N° 523/97 Para pruebas de IFI y Aglutinación de Partículas de Gelatina todos los participantes obtuvieron el 100% de aciertos con las 4 muestras.

Control de la Mujer Embarazada Infectada – Seguimiento del RN Laboratorio Departamento de DIAGNOSTICO INP “Dr. Mario Fatala Chabén” 800 mujeres embarazadas ( 50% Reactivas) Chagas Congénito 20 – 25 casos Tasa de Incidencia 6.3%

Algoritmo del recién nacido, hijo de madre chagásica serológico 1er control 10 - 20 días parasitológico Diagnóstico de certeza No reactiva 2do control serológico Reactiva (Tìtulos ≥ al titulo basal) 6 meses parasitológico Positivo Tratamiento 3er control serológico Positivo Tratamiento 12 meses parasitológico

DIAGNOSTICO DE LA INFECCION CONGENITA **LA IgM NO SIEMPRE SE DETECTA** Detección de Ac IgM contra Trypanosoma cruzi madiante el uso de Ag recombinantes. **LA IgM NO SIEMPRE SE DETECTA** CAUSAS: La infección es muy reciente o se produjo en el canal de parto La infección ocurrió tempranamente por Ej durante el primer trimestre Existe exceso de IgG materna, por lo tanto se suprime la síntesis de IgM específica. El bebe no tiene respuesta inmune normal Por lo tanto: La falta de anticuerpos IgM contra Ag derivados de epimastigotes de T. Cruzi no excluye la posibilidad de infección

TRANSMISION VERTICAL - TASA DE INCIDENCIA Total de niños estudiados PERIODO 1994-2004 Año Total de niños estudiados Total de niños Detectados(+) Tasa de incidencia 1994 180 12 6.7% 1995 337 17 5.0% 1996 418 18 4.3% 1997 436 24 5.5% 1998 410 21 5.1% 1999 466 36 7.7% 2000 421 29 6.4% 2001 422 6.9% 2002 440 6.6% 2003 442 25 5.4% 2004 383 27 5.8% TOTAL 4355 267 6.1%

TRANSMISION CONNATAL DISTRIBUCION DE POSITIVIDAD EN LA POBLACION INFANTIL SEGUN LA EDAD EN EL PRIMER CONTROL Edad Nº de Niños Porcentaje % Hasta ≤ 1 Mes 149 56% ≥2 Meses y ≤5 Meses 68 25% ≥6 Meses y ≤12 Meses 53 19% TOTAL 267 100%

INCIDENCIA DE PARASITEMIA POR TRYPANOSOMA CRUZI Y DE ANTICUERPOS ESPECÍFICOS EN NIÑOS ≥ 6 MESES Y ≤ 12 MESES QUE CONCURRIERON AL PRIMER CONTROL Edad Parasitemia (+) (-) Total Serología Reactiva No Reactiva Discordante(aIFI+) TOTAL 6 Meses 20 11 55% 6 30% 3 15% 7 Meses 16 8 50% 38% 2 12% 8 Meses 1 0% 9 Meses 7 4 25% 10Meses 100% 11Meses 12Meses 14 15 94% 6% 65 69 45 65% 21% 10 14% 69-100%

COMPORTAMIENTO DE LOS ANTICUERPOS ESPECIFICOS EN NIÑOS HIJOS DE MADRE CHAGASICA AL 6° MES SIN TRANSMISION CONNATAL AÑO N° NIÑOS ELISA/HAI ELISA/IFI HAI/IFI DISCORDANTE 2NR/1R TOTAL 1999 240 1 10 11 2000 182 13 2001 200 12 2002 2 15 18 822 100% 3 0.4% 48 5.8% 54 6.6%

CONCLUSION El Diagnóstico de infección chagásica en la embarazada es requisito previo para la sospecha de infección potencial del feto o del RN. La detección de la infección en el RN es de suma importancia para la implementación temprana y eficaz del tratamiento. Los métodos actuales, empleados para el Diagnóstico de certeza necesario para el tratamiento del bebé infectado pueden requerir hasta 9 meses.

Actualmente no existen procedimientos para prevenir ni predecir la transmisión del T. cruzi. Propuesta: estudiar la generación de los mediadores que regulan la respuesta inmune como preditores de a infección chagásica

Niveles de citoquinas en circulación IL-10 incrementa en la no-embarazada Tc+ y en la embarazada Tc- (* p<0.05 , ANOVA de 2 factores). Los niveles de TNF tienden a aumentar por la infección.

Niveles plasmáticos de citoquinas Embarazadas infectadas Sin trans Con trans Embarazadas infectadas Tc- Tc+ Bebés (* p<0.05, test t)

de madres con y sin transmisión de la infección Liberación espontánea de citoquinas, por leucocitos de sangre periférica, de madres con y sin transmisión de la infección Sin trans Con trans Embarazadas infectadas Sin trans Con trans Embarazadas infectadas Sin trans Con trans Embarazadas infectadas Los niveles de TNF fueron mayores en las madres sin transmisión ( * p<0.05, test t)

Niveles en circulación de citoquinas en bebés no infectados, hijos de madres infectadas por T. cruzi. ( * p<0.05, test t)

Conclusiones Los niveles circulantes de TNF fueron mayores en las mujeres que no transmitieron la infección que en aquellas que si lo hicieron La liberación espontánea de TNF fue mayor en las madres de niños no infectados en comparación con las madres de niños infectados Los hijos no infectados de madres infectadas presentaron mayores niveles plasmáticos de TNF que los infectados.

Perspectivas futuras TNF modulado por IL-10 sTNF-R1 y sTNF-R2 Evaluar la bioactividad del TNF Evaluar los niveles de los receptores sTNF-R1 y sTNF-R2 Evaluar la respuesta de los LP de los bebés en presencia de Ag de T. cruzi