UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE BAJA CALIFORNIA INSTITUTO DE INVESTIGACIONES EN CIENCIAS VETERINARIAS LABORATORIO DE SALUD PÚBLICA VETERINARIA II Congreso Internacional de Leptospirosis, Sífilis y Borreliosis "Espiroquetas Habana 2012" 23 - 25 de abril de 2012 La Habana, Cuba Borreliosis (Borrelia burgdorferi) y factores de riesgo en perros de una ciudad que sólo ha reportado garrapatas Rhipicephalus sanguineus en caninos, Mexicali, Baja California, México Luis Tinoco Gracia

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Mexicali, Baja California, México

INTRODUCCIÓN BORRELIOSIS (ENFERMEDAD DE LYME): Enfermedad inflamatoria multisistémica Transmitida por garrapatas Zoonótica Distribución mundial ETIOLOGÍA: Complejo Borrelia burgdorferi sensu lato. Norteamérica: B. burgdorferi sensu stricto (Johnson, 1984). Europa: B. afzelli y B. garinii (Berglund, 1995; Derdáková, 2003). Asia: B. japonica (Kawabata, 1993).

BANCO DE GENES National Center for Biotechnology Information (NCBI)

Ciclo biológico de I. scapularis relacionado con B. burgdorferi Transmisión de borrelias al huésped por garrapata adulta Huevos Larvas Transmisión de borrelias al huésped por ninfas Reservorio Otros vectores: I. pacificus, A. americanum, D. variabilis

BORRELIOSIS: Enfermedad inflamatoria multisistémica Depresión, emaciación Claudicación Garrapatas

ANTECEDENTES DE PREVALENCIA EN PERROS Monterrey, Nuevo León: 16% (136/850) a B. burgdorferi por IFA (Salinas-Meléndez et al., 1999) Mexicali, B. C.: 6.6% (2/30) a B. burgdorferi por ELISA (Romano et al., 1998) 8.2% (95% I.C. 1.5-13.3%) a B. burgdorferi por ELISA (Tinoco et al., 2007) 59.6% (56/94) a garrapatas (100% Rhipicephalus sanguineus) (Tinoco et al., 2008)

ANTECEDENTES DE PREVALENCIA EN HUMANOS Estados Unidos: Actualmente: 200,000 (CDC) República Mexicana: Por ELISA y Western blot Distrito Federal: 3.4% Noreste de la Rep. Mexicana: 6.2% (Gordillo et al., 2003) Por PCR y Secuenciación (Flagelina y OspA) Distrito Federal: 4 pacientes (Gordillo et al., 2007)

OBJETIVOS Estimar la prevalencia de B. burgdorferi por ELISA y PCR en perros atendidos en clínicas veterinarias y en perros capturados por los centros de control animal; y demostrar evidencia molecular en garrapatas por PCR, en Mexicali, Baja California, México. Evaluar factores de riesgo asociados a B. burgdorferi en perros de la zona urbana de Mexicali, Baja California. Demostrar la transmisión experimental de B. burgdorferi a través de la garrapata adulta R. sanguineus en perros.

MATERIAL Y MÉTODOS FASES DEL TRABAJO DE INVESTIGACIÓN Monitoreo de B. burgdorferi. Aislamiento de B. burgdorferi. Estudio experimental de la transmisión de B. burgdorferi por R. sanguineus.

1. MONITOREO MARCO MUESTRAL DEL AREA DE ESTUDIO Establecimientos: 39 clínicas veterinarias de la ciudad de Mexicali 2 centros de control animal de Mexicali Sujetos: (768) i) 384 Perros atendidos en clínicas veterinarias ii) 384 Perros capturados por los centros de control animal iii) Garrapatas recolectadas de los animales muestreados

Muestreo sanguíneo y de garrapatas Perros atendidos en clínicas veterinarias Perros capturados por los centros de control animal Garrapatas conservadas en tubos con etanol al 70% o congeladas a -20°C.

DIAGNÓSTICO PERROS Serología: Borrelia burgdorferi ELISA® Helica Biosystems, Inc. PCR: Sangre y líquido sinovial GARRAPATAS PCR: Glándula salival e intestino. Iniciadores: Fragmentos de genes codificantes de B. burgdorferi sensu lato a) Flagelina (FLA): 256 pb b) Proteína A de la superficie externa (OspA): 345 pb

SEROLOGÍA DE Borrelia burgdorferi PUNTO DE CORTE Densidad öptica > 1.6 1.0 – 1.5 Positivo 0.5 – 1.0 0.3 – 0.5 Corte 0.2 – 0.3 Negativo 0.1 – 0.2 <0.1 Sensibilidad = 95.8% Especificidad = 94.7% Punto de corte = 0.300 DO (Densidad óptica)

ANÁLISIS ESTADÍSTICO 1. Tamaño de muestra: n = tamaño de muestra, resultando 384 por cada grupo de estudio.  = estimador de varianza máxima 50 % Z = valor de tablas = 1.96 d = precisión = 5 % (Scheafer et al., 1987) 2. Se estimó la prevalencia y su intervalo de confianza mediante el estimador Rogan-Gladen (Greiner y Gardner, 2000). 3. Para evaluar la asociación de los factores de riesgo con la seropositividad a B. burgdorferi se utilizaron la razón de probabilidades (Odds ratio, OR) y X2 de Mantel-Haenszel. 4. Todos los análisis estadísticos utilizando el paquete SAS (Statistical Analysis System) para Windows ver 8.2 (Walker, 1997; SAS, 2004).

RESULTADOS Seroprevalencia ajustada de Borrelia burgdorferi ELISA® Helica Biosystems, Inc. Perros atendidos en clínicas veterinarias: 24/384 6.8% (95% CI 3.5-8.9) Perros capturados por los centro de control animal: 42/384 12.0% (95% CI 7.5-14.3) Ambos grupos: 66/768 9.3% (95% CI 6.3-10.6)

FACTORES DE RIESGO Perros de las clínicas veterinarias Parámetro X2 P OR (95% IC ) Edad 5.2724 0.02 4.7 (1.1-20.6) Falta de programa preventivo 7.8519 0.005 4.9 (1.4 -16.8)

EVIDENCIA MOLECULAR DE Borrelia burgdorferi - PCR Manhattan, Kansas, 26 de septiembre de 2007 PCR de FLA en sangre de perros seropositivos 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 256 pb 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 256 pb 41 42 43 44 45 46 47 48 49 256 pb

EVIDENCIA MOLECULAR DE Borrelia burgdorferi - PCR Manhattan, Kansas, 29 de septiembre de 2007 PCR de FLA en tejidos de perros seropositivos 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 256 pb 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 256 pb

EVIDENCIA MOLECULAR DE Borrelia burgdorferi - PCR Manhattan, Kansas, 30 de septiembre de 2007 PCR de OspA en tejidos, coágulos sanguíneos y garrapatas de perros seropositivos 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 345 pb 1. Marcador 2. C+ N40 3. 506 Coágulos sanguíneos Sero+ FLA+ 4. 2032 Coágulos sanguíneos Sero+ FLA+ 5. 675 Coágulos sanguíneos Sero+ FLA+ 6. 1312 Coágulos sanguíneos Sero+ FLA+ 7. 1272 M, sinovial Sero+ FLA+ 8. 1326 M, sinovial Sero+ FLA+ 9. ENS1 M, sinovial Sero+ FLA+ 10. 39 CA M, sinovial Sero+ FLA+ 11. 1165 Garrapatas Sero+ FLA+ 12. 1346 Garrapatas Sero+ FLA+ 13. C-

EVIDENCIA MOLECULAR DE Borrelia burgdorferi - PCR Mexicali, B.C., 22 de octubre de 2007 PCR de FLA en tejidos de perros seropositivos M 1 2 3 4 5 6 7 P N 256 pb

EVIDENCIA MOLECULAR DE Borrelia burgdorferi - PCR M. Marcador BioLadder 100 889 Coágulos sanguíneos 2063 Coágulos sanguíneos 1272 Coágulos sanguíneos 1368 Garrapatas 1272 Vejiga P. Positivo N. Negativo M. Marcador BioLadder 100 Mexicali, B.C., 19 de marzo de 2008 PCR de FLA en tejidos y garrapatas de perros seropositivos M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 P N M 256 pb

EVIDENCIA DE Borrelia burgdorferi - Secuenciación Manhattan, Kansas, 17 de octubre de 2007 Perro #1312  Muestra: Coágulo sanguíneo 100% de identidad con OspA de Borrelia burgdorferi TAACAATTTCTGACGATCTAGGTCAAACCACACTTGAAGTTTTCAAAGAAGATGGCAAAA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CACTAGTATCaaaaaaaGTAACTTCCAAAGACAAGTCATCAACAGAAGAAAAATTCAATG CACTAGTATCAAAAAAAGTAACTTCCAAAGACAAGTCATCAACAGAAGAAAAATTCAATG AAAAAGGTGAAGTATCTGAAAAAATAATAACAAGAGCAGACGGAACCAGACTTGAATACA CAGAAATTAAAAGCGATGGATCTGGAAAAGCTAAAGAGGTTTTAAAAGGCTATGTTCTTG AAGGAACTCTAACTGCTGAAAAAACAAC ||||||||||||||||||||||||||||

2. AISLAMIENTO Medio de cultivo: BSK-H® SIGMA + suero de conejo (6%) + gelatina de cerdo (6%) + rifampicina (100 mg/L) + fosfomicina (50 mg/L) + anfotericina B (2.5 mg/L) Fuente: Vejiga. Temperatura: 33°C Comprobación de crecimiento: Microscopia de campo obscuro Criopreservación : -20°C (CryoCare Bacterial Preservers® Key Scientific Products) Secuenciación: 99% Borrelia burgdorferi sensu stricto

3. TRANSMISION EXPERIMENTAL 3 perros sanos de 8 meses de edad, de talla mediana, pelaje corto. a) Grupo A: 2 perros expuestos a R. sanguineus con B. burgdorferi. b) Grupo B: 1 perro expuesto a R. sanguineus no infectadas.

Incubación y desarrollo de R. sanguineus Recolección de hembras adultas repletas recién alimentadas. Preovoposición: 4 d. Ovoposición: 5 d. Incubación de huevos: 11 d. Ayuno: 3 d. Colocación de larvas en perros: 3 d. Muda de larvas a ninfas: 7 d. Colocación de ninfas en perros: 4 d. Muda de ninfas a adultas: 11 d. Ayuno: 2 d. Inoculación de borrelias en hembras adultas: 1 d. Colocación de garrapatas adultas en perros: 7 d. Total del ciclo: 61 d. Incubación: 30°C con 80% de humedad.

CICLO DE R. sanguineus EN MEXICALI

Inoculación de B. burgdorferi en R. sanguineus 5 hembras adultas inoculadas/perro. El inóculo fue por capilaridad con medio BSK-H y Borrelia burgdorferi. Concentración: 1×108 espiroquetas/ml de BSK-H. En cámara húmedad a 34°C durante 24 horas.

Exposición experimental en perros a R. sanguineus infectadas con B. burgdorferi Colocación de 5 machos y 5 hembras adultas/perro. Duración: 7 días.

CONCLUSIONES Seroprevalencia de 6.8% (95% IC 3.5-8.9%) a B. burgdorferi en perros atendidos en clínicas veterinarias. Seroprevalencia de 12% (95% IC 7.5-14.3%) en perros capturados por los centros de control animal. Perros ≥ 1 año de edad: OR= 2.7 (95% IC 1.2-6.1). Perros que no tuvieron acceso a un programa preventivo: OR= 4.9 (95% IC 1.4-16.8). Evidencias serológicas y moleculares confirman la existencia de B. burgdorferi en perros y garrapatas en donde sólo se han registrado R. sanguineus. Hasta el momento no se ha comprobado la transmisión de B. burgdorferi por garrapatas adultas de R. sanguineus en perros utilizando el protocolo para Ixodes scapularis.

Modificación del protocolo de la transmisión experimental de B Modificación del protocolo de la transmisión experimental de B. burgdorferi a través de R. sanguineus: Utilizar 5 µL de medio BSK-H con 1×108 espiroquetas/ml como inóculo en lugar de 20 µL. Realizar la inoculación de borrelias incluyendo la fase de ninfa no sólo la adulta. Inocular con borrelias a 30 garrapatas hembras en lugar de 5 por cada perro de experimentación.

GRACIAS Mexicali, Baja California, México Tinoco.luis@yahoo.com