Transferencia de material genético II

Presentación del tema: "Transferencia de material genético II"— Transcripción de la presentación:

1 Transferencia de material genético II
Aislamiento de plásmidos

2 Objetivos Conocer los fundamentos para la purificación del DNA plasmídico y su separación del DNA Realizar el aislamiento de DNA plasmídico

3 Estructura del ADN James Watson y Francis Crick en demostraron que la estructura del ADN consiste en una doble hélice formada por dos cadenas.

4 DNA

5 DNA La extensión de DNA que tiene cada organismo no es la misma.
El DNA a pesar de su extensión tiende a formar una estructura helicoidal compacta.

6 Estructura del DNA Doble hélice Estabilizada por puentes de hidrógeno
En la célula generalmente superempacada o superenrollada

7 Conformaciones de un plásmido
Linealizado: Es decir cuando se ha cortado ambas cadenas del DNA sólo una vez. Parcialmente linealizado: Cuando se ha cortado el DNA en una de las cadenas DNA relajado circular. DNA que no se ha empacado. Superenrrollado: Covalentemente cerrado y muy empacado Superenrollado desnaturalizado. Parecido al anterior pero un poco menos empacado

8 Conformaciones distintas del DNA: Superenrollamiento

9 Pero como vemos el superenrollamiento?
Abierto Relajado Superenrollado El superenrollado es más compacto y por tanto migra más rápido en el gel

10 ¿Cómo afecta el superenrollamiento del DNA a la función de la célula?
Induce cambios locales en el DNA que desestabilizan la doble cadena y esto afecta la transcripción o cambia la unión de proteínas al DNA. Induce cambios globales en el DNA, los cual hace que secuencias de DNA distantes se acerquen y facilita la compactación del DNA y la recombinación sitio específica

11 Puentes de hidrógeno en el DNA
DNA estructura helicoidal Estructura estabilizada por puentes de hidrógeno entre las bases nitrogenadas (A=T; G≡C) Superenrollamiento Desnaturalizar- Renaturalizar: Romper y rehacer puentes de hidrógeno

12 DNA se puede desnaturalizar
Calor, pH,↑ iones se eliminan sus puentes de hidrógeno.

13 EFECTO HIPERCRÓMICO Al monitorear su absorbencia a 260 m se observa que hay un aumento en está conforme alteramos o despegamos la doble hélice EFECTO HIPERCRÓMICO

14 Tm Temperatura a la cual el 50% del DNA se encuentra en la forma desplegada.

15 La re-naturalización El DNA se puede volver a re- naturalizar.
Hay que hacerlo en condiciones suaves para que el apareo de bases sea el correcto. De no ser así se pueden producir agregados fácilmente precipitables.

16 Obtención del plásmido
Paso 1: Lisis celular Generalmente se realiza con detergentes lleva detergentes para solubilizar la membrana

17 Obtención del plásmido
Paso 2: Precipitación de proteínas y desnaturalización del DNA Se perturban los puentes de hidrógeno entre cadenas Se añade generalmente NaOH

18 Obtención del plásmido
Paso 3: Renaturalización del DNA Se neutraliza el pH de la solución y se renaturaliza el DNA, PERO NO TODO!!!

19 Fundamento Lisis alcalina
Cuando los puentes de hidrógeno entre las cadenas complementarias del DNA plasmídico circular se rompen, ya sea por calentamiento o por un pH alcalino, las cadenas permanecen cercanas ya que el enrollamiento de las dos cadenas no se ha perturbado grandemente. En contraste, las cadenas lineales o rotas de DNA cromosomal se renaturalizan rápidamente ya sea por enfriamiento o al restaurar el pH neutro de la solución y la fidelidad de la reasociación es substancialmente diferente para ambas macromoléculas.

20 Continuación... Paso 4: Separación del DNA cromosomal del DNA plasmídico y su purificación El DNA cromosomal está agregado y al centrifugar se queda en el botón El DNA renaturalizado se queda en la solución, el sobrenadante

21 El experimento

22

23 Cuantificación Una vez que se tenga el plásmido purificado entonces:
Correr una muestra en un gel de agarosa Medir la absorbancia a 260 nm. Estimar la concentración. Guardar a –20°C para usar en la próxima sesión

24 Siguiente sesión experimental
Continuamos con: Ensayo de restricción (2 h incubación de DNA con enzimas) Corrimiento electroforético: Gel de agarosa (aprox 45 min) Inducción de proteína recombinante (Alcanzar DO 0.6 en 1.5h; inducción 1.5h) Corrimiento electroforético: Gel de poliacrilamida (45 min) Siguiente sesión experimental

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26 Preparación de un gel de agarosa para el corrimiento electroforético del plásmido y los productos de restricción