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TECNOLOGIA DEL DNA RECOMBINANTE.
CAPITULO 15 TECNOLOGIA DEL DNA RECOMBINANTE. Manipulación del DNA ENZIMAS DE RESTRICCION / MAPAS DE RESTRICCION VECTORES DE CLONACION - TIPOS GENOTECAS - TIPOS CLONACION IDENTIF. DE SECUENCIAS CLONADAS METODOS PARA EL ANALISIS DE SECUENCIAS: SOUTHERN/ NORTHEN/WESTERN PCR SECUENCIACION
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BIBLIOGRAFIA Griffiths et al. (2000) Klug y Cummings (1999)
Tamarin (1999) Strachan et al. (1996) Kaplan et al. (1993) wwwhttp://
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ENZIMAS DE RESTRICCION
* Nucleasa sintetizada por las bacterias como un mecanismo de defensa natural * Nucleasa capaz de reconocer y cortar una secuencia específica de nucleótidos en una doble cadena * Longitud de la secuencia reconocida de 4 a 8 bp * Reconocen secuencias palindrómicas Primera enzima descubierta fue a partir de Haemophilus influenzae
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EXTREMOS COEXIVOS
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EXTREMOS ROMOS
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Mapas de restricción
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Mapas de restricción
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VECTORES DE CLONACION . REPLICACION AUTONOMA
. MAPA DE RESTRICCION CONOCIDO Un único pto. De corte . MARCADORES SELECTIVOS Resistencia antibióticos Cambios de color . RECUPERACION SENCILLA . TIPOS: Plásmidos, fagos, cósmidos, YACs, BACs, etc.
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BACs Polilinker Resistencia antibióticos Factor F de Bacterias:
plásmido con replicación autónoma, que transfiere información genética durante la conjugación bacteriana Polilinker Resistencia antibióticos
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CLONACION 1º Inserción del fragmento de DNA a clonar en un Vector de clonación: MOLECULA DE DNA RECOMBINANTE
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CLONACION 2º Introducción mol. DNA recombinante en hospedador (bacterias) 3º Vectores se multiplican de forma autónoma 4º Bacteria se divide 5º Un gran nº de copias dará lugar a un clon, con muchas copias del fragmento
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GENOTECA . Clonación de todas las secuencias del genoma
. Presente al menos una copia de cada gen . Nº de clones depende: - tamaño inserto - tamaño genoma . Tipos : genómicas, cromosómicas, cDNA ln ( 1-p) N : nº de clones N = P : Prob de recuperar ln ( 1-f) f: fracción genoma en el clon
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ln ( 1-f) f: fracción genoma en el clon
ln ( 1-p) N : nº de clones N = P : Prob de recuperar ln ( 1-f) f: fracción genoma en el clon Genoma humano: 3,0 x 106 Kb P : 99% f : Inserto 17 Kb - 1,7 x 104 /3 x 109 N : 8.1 x 105 fagos Genoma humano: 3,0 x 106 Kb P : 99% f : Inserto 5 Kb N : varios millones plásmidos Genoma humano: 3,0 x 106 Kb P : 99% f : Inserto 50 Kb N : cósmidos
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1º PASO SOUTHERN BLOTTING 3º PASO 2º PASO 4º PASO 5º PASO
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1º PASO: DESNATURALIZACION
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2º PASO: ANILLAMIENTO DE PRIMERS
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3º PASO: ELONGACION
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Método de Maxan y Gilbert
SECUENCIACION Método de Maxan y Gilbert
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Método de Maxan y Gilbert
SECUENCIACION Método de Maxan y Gilbert
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METODO DE SANGER 1º Paso: Desnaturalización 2º Paso: Adición de : dNTPs DNApolimerasa cebador 3ºPaso: adición de ddNTPs
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