Sistemas de modificación celular

Presentación del tema: "Sistemas de modificación celular"— Transcripción de la presentación:

1 Sistemas de modificación celular
Introducción Genes marcadores Técnicas de introducción de ADN en las células animales en cultivo Transfección Métodos químicos Métodos físicos Establecimiento de líneas de expresión estable Transducción: vectores virales Adenovirus Retrovirus y Lentivirus Métodos de introducción de proteínas

2 ADN: construcciones con la secuencia codificante del gen de interés,…
Manipulación del cultivo celular para la modificación de la expresión y/o función de los genes. Ácidos nucleicos ADN: construcciones con la secuencia codificante del gen de interés,… ARN: puede ser codificante o regulador (RNAi o antisense) Proteínas: para evaluar su función o inhibirla con proteínas competidoras (dominante negativo) Anticuerpos: para neutralizar la función de una proteína Ma Para cambiar la homeostasis de una célula podemos introducir distintas moléculas según nuestro objetivo. Ácidos nucleicos los cuales pueden codificar por un gen de interés que queremos que se exprese (ADN o ARNm) o bién moléculas que actuarán como reguladoras de la expresión de los genes de la célula (RNAi o antisense) Proteínas: con el fín de evaluar su función en el entorno celular o proteínas que sean capaces de bloquear la función de una proteína endógena (dominantes negativos). Normalmente son la misma proteína con una mutación que la inactiva. Anticuerpos: la introducción de anticuerpos normamente se hace con el fin de bloquear la función de la proteína a la cual se unen específicamente.

3 ¿Con qué finalidad queremos introducir ADN en una célula?
Conferirle ventajas selectivas (ej. resistencia a una sustancia tóxica) Caracterizar la función de la proteína de interés Conocer la localización subcelular de una proteína (proteína marcada) Facilitar el estudio de la regulación de la expresión de un gen (región reguladora de la expresión del gen + gen marcador) Obtener proteína recombinante procesada correctamente por células de mamífero ¿Con qué finalidad queremos introducir ADN que codifique por una proteína en una célula que ya tiene todos los genes que necesita para vivir y dividirse? Pueden existir motivos muy diversos, pero como ejemplo he puesto varias posibles razones: Conferir a la célula ventajas selectivas, es decir que pueda sobrevivir en unas condiciones que las otras células no superarán, por ejemplo crecer en presencia de una sustancia tóxica. También puede interesar caracterizar la función que tiene la proteína para la que codifica el ADN que hemos introducido. Podría ser interesante introducir una proteína marcada con una señal que nosotros podremos detectar, para poder conocer dónde se encuentra dentro de la célula (citoplasma, núcleo, mitocondrias, membrana…) Podríamos querer estudiar la región promotora de un gen, para saber cñomo se regula su expresión O también podemos querer utilizar las células como fábricas para la producción de un proteína con interés farmacológico por ejemplo.

4 Condiciones ideales de introducción del ADN
Eficiencia máxima Toxicidad nula El método y las condiciones óptimos para cada tipo celular se tienen que establecer empíricamente ¿Qué pretendemos obtener cuando introducimos ADN en células en cultivo? Idealmente, nosotros lo que querríamos es obtener una eficiencia de transfección del 100%, por lo tanto que todas las células expresen el transgen, y que además todas sobrevivan a la modificación, por lo tanto toxicidad nula. Estos resultados son muy difíciles de obtener, y normalmente nos conformamos con elegir la condición que nos de una eficiencia suficiente para lo queramos analizar sin causar mucha muerte celular. De hecho se tiene que establecer el método y las condiciones óptimos para cada tipo celular empíricamente.

5 Estrategias de introducción de ADN
Transfección: introducción del gen exógeno por métodos químicos o físicos Vector: plásmido de expresión Transducción o infección: introducción del gen exógeno mediante vectores virales Vector: material genético del virus En el caso de introducción de ADN en las células se utilizan dos estrategias: La transfección que consiste en la introducción del ADN por métodos químicos o físicos. En este caso el vector utilizado es un plásmido de expresión de células de mamífero. La infección que consiste en la utilización de virus para la introducción del ADN exógeno, aprovechando que son organismos especializados en la introducción de su material genético dentro de células eucariotas, puesto que su replicación depende de esto. En este caso el vector que se utiliza es el material genético propio del virus.

6 Amplificación del vector en bacterias
Transfección: vector Amplificación del vector en bacterias Componentes de un plásmido de expresión de células de mamífero: Origen de replicación en bacterias (ColE1): para mantener y amplificar el ADN Gen de resistencia a un antibiótico (p.e. ampicilina): para seleccionar las bacterias que tienen el plásmido Promotor secuencia que controla la expresión del transgen (p.e. pRSV expresión elevada y constitutiva) Sitio de clonage: “multi cloning site” MCS (donde se introduce la secuencia de ADN de interés) Señal de poliadenilación (finalización del ARN mensajero) Gen de resistencia a un antibiótico para la selección de las células que han incorporado el plásmido en su genoma (p.e. Neomicina o Higromicina). Expresión del gen en células de mamífero y selección de clones estables Modificada Hemos dicho que en la transfección el vector que se utiliza es el plásmido de expresión de células de mamífero. Ya habreis visto en detalle los componentes de un plásmido de expresión en la asignatura de Ingeniería Genética molecular, pero a modo de recordatorio: un plásmido es una doble cadena de ADN extracromosómico normalmente circular que tienen las bacterias y eucariotas inferiores, como las levaduras. Mediante técnicas de ingeniería genética los plásmidos se han modificado para su utilización como vectores de expresión. Los plásmidos se amplifican y purifican a partir de bacterias, para ello contienen un origen de replicación basteriano (ColE1) y también un gen de resistencia a un antibiótico (como la ampicilina) para seleccionar las bacterias que tienen el plásmido. Para el subclonaje y la expresión del transgen en células de mamífero el plásmido ha de contener también: Un promotor fuerte que confiere una expresión elevada y constitutiva de la proteína. Un sitio de clonaje con varias dianas de restricción para introducir la secuencia codificante del gen de interés. A continuación contiene una señal de poliadenilación para la cola de A del ARNmensajero. Y puede contener también un gen de resistencia a un antibiótico para la selección de las células que han integrado el plásmido en su genoma.

7 Vector de expresión para células de mamífero
MCS: multi cloning site Seq. de poliadenilación Promotor Promotor Gen de resistencia a la neomicina (selección en céls. mamífero) Vector de expresión para células de mamífero. Aquí está dibujado el mapa de un vector de expresión de células de mamífero como ejemplo con todas las cassettes que comentado en la diapositiva anterior. Para amplificación y selección en bacterias Seq. de poliadenilación

8 Genes marcadores o “reporter”
Codifican para proteínas de fácil detección Permiten: Controlar la eficiencia de entrada del ADN Estudiar la regulación de la expresión de un gen Monitorizar la localización subcelular de la proteína Aplicaciones: Normalización de los ensayos de expresión Seguimiento de una proteína marcada con un gen reporter Optimización de la metodología de introducción del ADN ¿ Cómo vamos a saber si el ADN ha entrado en la célula y qué eficiencia de transfección tenemos con un método determinado? Para la evaluación de la eficiencia de transfección y como sistema de normalización entre distintos experimentos se utilizan los genes marcadores o reporter. Son genes que codifican para enzimas o proteínas que nosotros mediante técnicas estandarizadas podemos medir o detectar.

9 Genes “reporter” más comunes
Chloramphenicol acetyl transferase (CAT) Enzima bacteriano que transfiere grupos acetilo del acetil-coenzima A al antibiótico cloranfenicol. El ensayo CAT se realiza con cloranfenicol radiactivo por lo que se detecta por autorradiografía. Luciferasa (luc) Enzima expresado en la luciérnaga Photinus pyralis. Cataliza la oxidación de las luciferinas, reacción que emite luz. La producción de luz se puede medir con un luminómetro. -galactosidasa (-gal or lacZ) Enzima bacteriano muy versátil, su actividad se puede medir tanto en extractos celulares con un espectrofotómetro (aparición de producto coloreado) y por métodos histoquímicos con la aparición de un precipitado azul en las células que lo expresan. Chloramphenicol acetyl transferase (CAT) - This is a bacterial enzyme that catalyzes the transfer of acetyl groups from acetyl-coenzyme A to the antibiotic chloramphenicol. A disadvantage of CAT reporter genes is that the CAT assay is laborious and expensive. Luciferase (luc) - Protein expressed from the luc gene of the firefly species Photinus pyralis can be easily detected in cell extracts using a specially designed luminometer that measures light emitted from the luc-catalyzed ATP-dependent oxidation of compounds called luciferans. Reporter genes containing the luc gene from the sea pansy Renilla reniformis can be used in combination with the firefly luc reporter gene as an internal control for DNA transfection efficiencies. -galactosidase (-gal or lacZ) - This bacterial enzyme is one of the most versatile reporter genes available because -gal enzyme activity can both be measured in cell extracts using a spectroscopic assay that detects cleavage of ONPG (o-nitrophenyl--D-galactopyranoside), and by histocytochemical methods that measure the appearance of a blue precipitate produced from the cleavage of X-gal. Los genes marcadores que se han utilizado más son: La “cloranfenicol acetiltransferasa” que es un enzima que inactiva el cloranfenicol mediante la transferencia de grupos acetilo. El ensayo de actividad de esta enzima normalmente es laborioso, con cloranfenicol radiactivo y resulta caro por lo que en la actualidad no se utiliza mucho. Se utilizaba mucho para el estudio de activación de promotores. La luciferasa es una enzima de un luciérnaga, que cataliza la oxidación de las luciferinas, reacción que emite luz. La luz producida se puede medir y cuantificar en una aparato que se llama luminómetro. Es un ensayo fácil y rápido. La beta-galactosidasa es un enzima más versátil que los anteriores porque además de poder hacer la cuantificación a partir de lisados celulares con un simple espectrofotómetro, también permite la visualización de las células transfectadas por métodos histoquímicos, pudiendo tener una medida de la eficiencia de transfección.

10 Genes “reporter” más comunes
Green fluorescent protein (GFP) El gen de esta proteína autofluorescente ha sido el gen marcador más útil para visualizar las células transfectadas in vivo. La GFP se obtuvo de la medusa Aequorea victoria. La exposición de la GFP a luz ultravioleta produce la emisión de una luz verde brillante en células vivas, sin la necesidad de añadir ningún sustrato o producto. En la actualidad se han clonado proteínas fluorescentes a partir de otras especies de medusa, anémonas y corales Nuevas proteínas fluorescentes disponibles: Green fluorescent protein (GFP) - The gene for this autofluorescent protein has rapidly become one of the most useful reporter genes for marking transfected cells in vivo. GFP is expressed in the outer dermal layer of the Pacific Northwest jellyfish Aequorea victoria. GFP autofluorescence provides a green bioluminescent light to the jellyfish in response to a calcium-dependent energy transfer step involving a GFP-associated protein called aequorin. It was found that exposure to ultraviolet light causes GFP to autofluoresce a bright green color within living cells, even in the absence of aequorin, calcium, or any other cofactor or substrate El gen marcador que ha resultado más útil para la detección de células transfectadas vivas es el gen de la proteína verde fluorescente (GFP). Este gen se clonó de la medusa Aequorea victoria. La GFP cuando se expone a luz ultravioleta emite luz de color verde brillante que se puede ver mediante un microscopio de fluorescencia. Por lo tanto se puede monitorizar la expresión de la GFP tras la transfección sin necesidad de lisar las células. En la actualidad existe una amplia gama de proteínas fluorescentes que se han obtenido a partir de distintos organismos. AmCyan1 ZsGreen1 ZsYellow1 DsRed1 AsRed2 HcRed1.

11 Métodos de Transfección
Métodos químicos: Se mezcla el ADN con moléculas cargadas positivamente que facilitan la entrada del ADN en la célula (moléculas portadoras o “carrier”) Métodos físicos: Introducción del ADN de forma directa Los métodos de transfección se clasifican en dos grupos dependiendo del tipo de estrategia que se utiliza: Métodos químicos- se mezcla el ADN cargado negativamente con moléculas de carga positiva, se forman complejos y estos pueden entrar en la célula por endocitosis Métodos físicos- se introduce el ADN de forma directa dentro de la célula o se fuerza su entrada.

12 Métodos de Transfección
Métodos químicos: Coprecipitación con fosfato cálcico DEAE-dextrano Lípidos catiónicos Polyethylenimine (PEI) Métodos físicos: Electroporación Microinyección “Biolistic Particle Delivery” o “Gene gun” Magnetofección En cuanto a los métodos químicos existe una gran variedad de posibilidades: La coprecipitación del ADN con fosofato cálcico El DEAE-dextrano Los lípidos catiónicos La polietilenemine (PEI) Después existen productos comerciales que pueden contener varios componentes, como el FuGENE6 Los métodos físicos más utilizados son: La electroporación La microinyección del ADN dentro de la célula Método biolístico Magnetofección

13 Barreras que tiene que superar el ADN
La eficiencia de transfección depende de la superación de varias barreras: adsorción del complejo de transfección en la superfície celular y entrada del complejo en la célula (membrana plasmática) liberación del ADN del endosoma y escape a la degradación lisosomal translocación a través de la membrana nuclear y entrada en el núcleo De hecho no es suficiente hacer entrar el ADN dentro de la célula, a parte de superar la barrera de la membrana plasmática, el ADN dentro de la célula tiene que liberarse de las vesículas del endosoma, evitar la degradación y entrar en el núcleo donde está toda la maquinaria transcripcional, y hay sistemas de transfección que son más eficientes que otros en superar todas estas barreras.

14 Precipitados de CaPO4 con ADN
1. Métodos químicos Coprecipitación con fosfato cálcico: precipitado de complejos fosfato cálcico-ADN que son endocitados por la célula ADN + CaCl2 Añadir Na2PO4 en tampón Precipitados de CaPO4 con ADN endocitosis La coprecipitación con fosfato cálcico consiste en mezclar el ADN con cloruro cálcico, y después añadir tampón fosfato para que se formen los precipitados de fosfato cálcico conteniendo el ADN los cuales se depositan sobre las células y son endocitados. Este método se ha utilizado mucho porque es muy económico y para determinados tipos celulares funciona muy bién.

15 Se utiliza solo en transfecciones transitorias.
1. Métodos químicos DEAE-dextrano (dietilaminoetil-dextrano): complejos de polímeros DEAE-dextrano y ADN, se introducen por shock osmótico con DMSO o glicerol Se utiliza solo en transfecciones transitorias. El método del DEAE-dextrano consiste en la formación de complejos del polímero cargado positivamente con el ADN, y para promover la entrada de los complejos se hace un shock osmótico con DMSO o con glicerol. Este método solo se utiliza en transfecciones atrnasitorias como veremos más adelante.

16 Este método recibe el nombre de Lipofección
1. Métodos químicos Lípidos catiónicos: los liposomas catiónicos se acomplejan con el ADN y al fusionarse con la membrana celular, facilitan la entrada del ADN a través de endosomas Uno de los métodos que es muy utilizado en la actualidad es el de los liposomas catiónicos. Se mezcla el ADN con liposomas cargados positivamente y estos hacen de carriers del ADN, facilitando su entrada cuando se fusionan con la membrana plasmática. Este método también recibe el nombre de lipofección, y existen muchas casas comerciales que venden sistemas de transfección basados en esta estrategia. Este método recibe el nombre de Lipofección

17 Protocolo de Lipofección
Como ejemplo, aquí teneis el protocolo que se sigue en una lipofección: El primer día se siembran las células para que al día siguiente estén bién adehridas y dividiéndose. El segundo día se diluye el DNA y se mezcla con los liposomas Se incuba la mezcla durante min para dejar que se formen los complejos. Se retira el medio de las células y se añade la mezcla de transfección. Se incuban las células a 37ºC durante unas horas (1h a 6h) Se añade medio de crecimiento y se incuban durante 1-2 días hasta que se analiza la expresión del transfen.

18 1. Métodos químicos Lípidos catiónicos: Alta eficiencia de transfección y baja toxicidad en determinados tipos celulares La lipofección da una eficiencia de transfección alta y baja toxicidad, aunque resulta un método más caro que los otros métodos químicos. Aquí hay ejemplos del ensayo de beta-galactosidasa en distintas líneas celulares transfectadas por lipofección. Gen marcador: -galactosidasa

19 1. Métodos químicos PEI (polyethylenimine): Es un polímero catiónico sintético que genera complejos con el ADN. Estos complejos interaccionan con los proteoglicanos aniónicos de la membrana y entran por endocitosis Un método que funciona muy bíén para determinados tipos celulares es el método del PEI (polietilenimine) Es un polímero catiónico sintético que se acompleja con el ADN, interacciona con los proteoglicanos aniónicos d ela membrana plasmática y entra por endocitosis. Es un método económico pero que sirve para todos los tipos celulares.

20 1. Métodos químicos PEI Lípidos catiónicos
Comparación entre dos métodos de transfección en células HEK293 PEI Lípidos catiónicos Para que veais que no todos los métodos dan una eficiencia de transfección similar, aquí hay imágenes de un mismo tipo celular transfectado con dos métodos distintos. En este caso el PEI da una eficiencia mucho mejor que la lipofección, pero esto podría ser al revés para otro tipo celular. De ahí la importancia de probar distintos métodos y varias condiciones antes de elegir cómo transfectar un tipo celular determinado. Gen marcador: GFP (green fluorescent protein)

21 1. Métodos químicos Comparación de la eficiencia de la lipofección entre distintas líneas celulares DNA transfection of various cell lines, including CHO-K1, COS-7, NIH3T3, HeLa S3, with CellLine Transfection Reagent Un mismo método de transfección no da la misma eficiencia en distintos tipos celulares. Aquí teneis imágenes de exxpresión de la GFP en distintas líneas celulares transfectadas for lipofección, como veis la eficiencia varia según la línea celular.

22 Factores que pueden influir en la eficiencia de Transfección
Presencia de antibióticos El complejo puede interaccionar con el antibiótico disminuyendo la eficacia y aumentando la toxicidad Presencia de suero El suero puede disminuir la eficiencia de transfección Aunque la ausencia de suero puede hacer el liposoma más tóxico para las células Se ha visto que hay factores que pueden influir negativamente en la eficiencia de transfección: La presencia de antibióticos que pueden interferir en la formación de los complejos La presencia de suero puede dificultar la formación de los complejos, aunque por otro lado en ausencia de suero los liposomas pueden ser más tóxicos. Normalmente la formación de los complejos ADN-carrier se hace en medio sin suero y sin antibiótico.

23 2. Métodos físicos Microinyección: consiste en la inyección directa del ADN al citoplasma o núcleo de la célula Biolístico (biological ballistics): implica la introducción de micropartículas de tungsteno u oro recubiertas con ADN con una pistola de helio. Electroporación: se basa en la generación de un shock eléctrico corto que origina pequeños orificios a la membrana que permiten la entrada del ADN. Elevada eficiencia, pero también elevada muerte celular Magnetofección: utiliza nanopartículas magnéticas para facilitar la entrada del ADN en las células En cuanto a los métodos físicos de transfección nos encontramos con: Microinyección: inyección directa del ADN al citoplasma o núcleo de la célula Biolístico: bombardeo con micropartículas de tungsteno u oro recubiertas con ADN. Se utiliza una pistola especial que proyecta las partículas mediante gas a pressión (helio) Electroporación: En este caso se somete a las células a un shock eléctrico corto que produce poros en la membrana plasmática, por donde puede entrar el ADN. Con este método se puede obtener elevada eficiencia, pero también produce elevada muerte celular.

24 Microinyección Introducción de soluciones de macromoléculas mediante capilares finos de vidrio que se manipulan bajo un microscopio. La microinyección se debe realizar con un aparato especial controlando todo el proceso bajo el microscopio. Por microinyección se puede introducir cualquier tipo de macromolécula.

25 Microinyección Limitaciones
Dificultad técnica (requiere personal y instrumentación especializados) Manipulación individualizada de las células (elevado consumo de tiempo) Seguimiento individual de cada célula microinyectada Aplicaciones más corrientes: Microinyección de células adherentes en cultivo Generación de animales transgénicos (microinyección de ADN en el pronúcleo masculino del zigoto) Fecundación in vitro de oocitos (inyección de esperma en el citoplasma del oocito) La microinyección presenta ciertas limitaciones en su aplicación: Es una técnica difícil y además requiere del instrumental adecuado El número de células que se pueden microinyectar por sesión es limitado, porque es un procedimiento muy laborioso. Después de la microinyección se tiene que hacer el seguimiento de cada célula individualizada. A pesar de sus limitaciones, se ha utilizado mucho para ciertas aplicaciones. Por ejemplo la generación de animales transgénicos y knock-out/knock-in, también en el clonaje de animales, en la fecundación in vitro, etc

26 Biolistic particle delivery
Método de transfección mediante bombardeo de las células con micropartículas de oro o tungsteno recubiertas con ADN o ARN. Helios Gene Gun - BioRad Aplicaciones: Recomendado para células resistentes a otros métodos y especialmente para células vegetales El método biolístico es una buena estrategia para introducción de ADN en células resistentes a los métodos químicos de transfección. Consiste en el bombardeo de las células con micropratículas de tungsteno u oro, que han sido previamente recubiertas con el ADN que se quiere introducir. En la foto hay una pistola de helio de Bio-rad que recibe el nombre de “gene gun”. El video muestra de forma esquemática el procedimiento que se seguiría en la transfección de células vegetales por “gene gun”.

27 Electroporación Introducción de macromoléculas en las células mediante la exposición a un pulso eléctrico de elevada intensidad y corta duración que provoca la apertura de poros en la membrana plasmática. Ventajas: Técnica simple, reproducible y de gran eficacia Desventajas: Requiere desenganchar las células del sustrato Mucha mortalidad celular Se tienen que ajustar las condiciones para cada tipo celular La técnica de la electroporación aprovecha el hecho que la exposición de las células a un campo eléctrico de elevada intensidad provoca la despolarización de la membrana plasmática y la formación de poros, que al cesar el pulso eléctrico se vuelven a cerrar. La apertura de poros, hace la célula permeable al ADN, el cual puede entrar al citplasma y qyedar atrapado dentro cuando se vuelven a cerrar. Es una técnica simple, reproducible y de gran eficacia. De hecho también se utiliza para la transformación de bacterias. Presenta ciertas desventajas, normalmente la electroporación se realiza en cubetas que tiene los electrodos, y por lo tanto las células tienen que estar en suspensión. Esta técnica provoca una elevada mortalidad celular, muchas células son lisadas por el pulso eléctrico, por lo que las condiciones que dan mejor eficiencia normalmente provocan la muerte del 20 al 60% de las células. Se tienen que ajustar las condiciones para cada tipo celular y hacer pruebas de optimización.

28 Electroporación Parámetros: Amplitud del pulso (Voltaje en kV/cm)
Longitud del pulso (de seg a mseg) Normalmente las condiciones que permiten una mayor eficiencia de transfección provocan una muerte celular de entre el 40 y el 60% En la actualidad existen también sistemas de electroporación para células adheridas al sustrato y para realizar electroporaciones in vivo. Para la electroporación se tiene que ajustar dos parámetros: La amplitud del pulso (o voltaje) Y la longitud del pulso (tiempo) o bién la capacitancia (son parámetros dependientes) Las condiciones que dan mayor eficiencia de transfección provocan una muerte celular de entre el 40 y el 60% En la actualidad también encontramos sistemas de electroporación para células adheridas al sustrato y para electroporar in vivo.

29 Magnetofección MATra - Magnet Assisted Transfection
Utilización de nanopartículas magnéticas para mejorar la entrada de biomoléculas, como el ADN, dentro de las células. Magnetofection is a simple and highly efficient transfection method that uses magnetic fields to concentrate particles containing nucleic acid into the target cells.[1] This method attempts to unite the advantages of the popular biochemical (cationic lipids or polymers) and physical (electroporation, gene gun) transfection methods in one system while excluding their inconveniences (low efficiency, toxicity). Magnetofection was invented by Christian Plank and Christian Bergmann and is registered as a trademark. Principle The magnetofection principle is to associate nucleic acids with cationic magnetic nanoparticles: these molecular complexes are then concentrated and transported into cells supported by an appropriate magnetic field.[2] In this way, the magnetic force allows a very rapid concentration of the entire applied vector dose onto cells, so that 100% of the cells get in contact with a significant vector dose. Applications Magnetofection has been adapted to all types of nucleic acids (DNA, siRNA, dsRNA, shRNA, mRNA, ODN…), non viral transfection systems (transfection reagents) and viruses. It has been successfully tested on a broad range of cell lines, hard-to-transfect and primary cells.[3] Mechanism The magnetic nanoparticles are made of iron oxide, which is fully biodegradable, coated with specific cationic proprietary molecules varying upon the applications. Their association with the gene vectors (DNA, siRNA, ODN, virus, etc.) is achieved by salt-induced colloidal aggregation and electrostatic interaction. The magnetic particles are then concentrated on the target cells by the influence of an external magnetic field generated by magnets. The cellular uptake of the genetic material is accomplished by endocytosis and pinocytosis, two natural biological processes. Consequently, membrane architecture & structure stays intact, in contrast to other physical transfection methods that damage the cell membrane. The nucleic acids are then released into the cytoplasm by different mechanisms depending upon the formulation used: 1) is the proton sponge effect caused by cationic polymers coated on the nanoparticles that promote endosome osmotic swelling, disruption of the endosome membrane and intracellular release of DNA form, 2) is the destabilization of endosome by cationic lipids coated on the particles that release the nucleic acid into cells by flip-flop of cell negative lipids and charged neutralization and 3) the usual viral infection mechanism when virus is used. Magnetofection works for primary cells and hard to transfect cells that are not dividing or slowly dividing, meaning that the genetic materials can go to the cell nucleus without cell division. Coupling magnetic nanoparticles to gene vectors of any kind results in a dramatic increase of the uptake of these vectors and consequently high transfection efficiency. Biodistribution of magnetic nanoparticles The biodegradable cationic magnetic nanoparticles are not toxic at the recommended doses and even higher doses. Gene vectors / magnetic nanoparticles complexes are seen into cells after minutes that is much faster than any other transfection method. After 24, 48 or 72 hours, most of the particles are localized in the cytoplasm, in vacuoles (membranes surrounded structure into cells) and occasionally in the nucleus. References ^ Plank C, Schillinger U, Scherer F, et al (2003). "The magnetofection method: using magnetic force to enhance gene delivery". Biol. Chem. 384 (5): PMID   ^ Scherer F, Anton M, Schillinger U, et al (2002). "Magnetofection: enhancing and targeting gene delivery by magnetic force in vitro and in vivo". Gene Ther. 9 (2): DOI: /sj.gt PMID   ^ Plank C, Anton M, Rudolph C, Rosenecker J, Krötz F (2003). "Enhancing and targeting nucleic acid delivery by magnetic force". Expert opinion on biological therapy 3 (5): DOI: / PMID   La magnetofección es una combinación de los grupos de métodos, químico y físico. Consiste en la utilización de nanopartículas magnéticas (de óxido de hierro) las cuales se recubren del ADNA que se quiere introducir, y con la ayuda de un imán se pueden concentrar en la superfície celular y entrar por endocitosis o pinocitosis. Es un método muy rápido, eficiente y no es tóxico para las células. El vídeo ilustra el procedimiento que se sigue en una magnetofección.

30 Tipos de transfección Transfección transitoria: expresión de la proteína exógena durante un período corto (1 a 4 días). El ADN no se integra en el genoma de la célula. Transfección estable: permite la expresión de la proteína indefinidamente (en teoría). Se consigue mediante la selección de los clones que hayan incorporado el plásmido en su genoma (Tasa de inserción= 1 célula de cada 10000). Dependiendo del tiempo que se mantiene la expresión del transgen hablamos de transfección transitoria o de transfección estable. En la transfección transitoria el ADN exógeno se mantiene en la célula en forma extracromosómica por lo que la expresión del transgen es transitoria (entre 1 y 4-5 días). Después de este tiempo la expresión disminuye y se pierde porque el ADN termina degradándose. En la transfección estable se pretende obtener células que hayan incorporado el transgen en su genoma, y que por lo tanto mantengan la expresión de forma estable. Esta integración del ADN transfectado ocurre al azar con una frecuencia de 1 de cada células. Para ello se tiene que hacer una selección de las células estables con una antibiótico de selección, normalmente G418, higromicina o puromicina)

31 Transfección transitoria vs. Transfección estable
Ventajas Elevado nivel de expresión Es fácil co-expresar varias proteínas Procedimiento fácil y rápido Inconvenientes Variabilidad en el porcentaje de células expresoras (población celular heterogénea) Obtención de poca cantidad de proteína (producción temporal) Requiere gran cantidad de plásmido Transfección estable Ventajas Población celular homogénea (clonal) Producción continua de proteína (teóricamente) Almacenamiento de células expresoras del transgen Estas dos modalidades de transfección conllevan unas ventajas y unos inconvenientes por lo que en cada caso se tendrá qué valorar qué procedimiento seguir según los objetivos finales del estudio. La transfección transitoria produce elevados niveles de expresión, aunque el porcenteg de células que expresan el transgen es variable. Es fácil de poder expresar a la vez varios genes (cotransfección). No se puede llegar a obtener grandes cantidades de proteína porque la expresión es transitoria. Necesitas mucha cantidad de plásmido porque de hecho no se transmite de célula a célula. El método de transfección transitoria es rápido y fácil. En cuanto a la transfección estable, el ADN exógeno se integra en una región de un cromosoma, al azar y se integran pocas copias, por lo que los niveles de expresión son más bajos que en la expresión transitoria. Es más difícil de co-expresar varias proteínas a la vez. Requiere de la selección clonal con un antibiótico y esta selección representa el trabajo de más de un mes. La población celular es más homogénea porque proviene de una única célula. Potencialmente puede ser una fuente inacabable de proteína recombinante. Inconvenientes Integración del transgen al azar en el genoma celular Niveles de expresión moderados Es complicado obtener la co-expresión de varias proteínas Procedimiento laborioso y largo de selección clonal

32 Clones estables: procedimiento de obtención
Transfección 1/10000 céls. 2 días Adición antibiótico 1-2 semanas Muerte masiva células no estables 2 semanas Se cultivan y amplifican para testar y caracterizar la expresión del gen Colonias de células estables Se tripsinizan individualemente Una vez las células han sido transfectadas por cualquiera de los métodos descritos anteriormente (excepto del DEAE-dextrano). Se añade el antibiótico de selección al cultivo, y al cabo de 7-10 dias se observa una muerte masiva del cultivo, todas las células que no han integrado el transgen, mueren y se desenganchan de la placa y sólo quedan algunas células (1 de cada células que han sido transfectadas aprox). Estas después de una semanas habrán formado colonias como la de la imagen, y se podran aislar con cilindros de clonaje, cultivar aisladamente y amplificar. Una vez se han amplificado se testan por la expresión del transgen y se eligen los clones que tengan mejor expresión. 2 meses 1 mes

33 Clones estables: selección con antibiótico
Sin selección Con selección muerte de células no expresoras aparición de clones resistentes crecimiento de los clones estables Aquí teneis imágenes de las células en los distintos pasos del proceso de selección. En los plásmidos de expresión podemos encontrar distintas cassettes de resistencia. Las más habituales son la NEO el antibiótico de selección es la geneticina o G418, la HYG que confiere resistencia a la higromicina-B y PAC que confiere resistencia a la puromicina. Estos tres antibióticos actuan inhibiendo la síntesis proteica. Cassettes de resistencia: NEO: Selección con G418 ( mg/ml) HYG: Selección con Higromicina-B ( mg/ml) PAC: Selección con puromicina (0.5-5 mg/ml) Estos antibióticos actuan inhibiendo la síntesis proteica

34 Tema 9. Sistemas de modificación celular
Introducción Genes marcadores Técnicas de introducción de ADN en las células animales en cultivo Transfección Métodos químicos Métodos físicos Establecimiento de líneas de expresión estable Transducción: vectores virales Adenovirus Retrovirus y Lentivirus Métodos de introducción de proteínas

35 Transducción: vectores virales
Adenovirus Retrovirus Lentivirus Herpes virus Adeno-associated virus

36 Vectores virales: Adenovirus
Grupo de virus benignos, baja patogenicidad (ej. resfriado común) Genoma: ADN de doble cadena linear con una proteína unida covalentemente al extremo 5’ (TP: terminal protein). Longitud aprox. 36 kb Simetria icosahédrica ( nm diámetro) Proteínas de la cápside: Hexon, penton base, fibra globular

37 Vectores virales: Adenovirus
Ciclo del Adenovirus Entran mediante la unión (alta afinitat) a receptores específicos de la célula diana mediada por el extremo globular de la fibra Endocitosis del virus Sale del endosoma y transloca al núcleo El ADN viral entra en el núcleo y empieza la transcripción La transcripción, la replicación y el empaquetado tienen lugar dentro del núcleo de la célula infectada.

38 Vectores virales: Adenovirus
Genoma del Adenovirus Se transcriben las dos cadenas de ADN Transcripción en dos fases: Early: E1, E2, E3 i E4 (antes de la replicación del ADN) Late: (después de la replicación del ADN)

39 Vectores virales: Adenovirus
Vector Adenoviral Virus deficientes en la replicación- deleción de las regiones E1 (esencial para la replicación) y E3 (modulación respuesta immune huésped). El inserto puede ser de 7 a 8 kb (gene-X) Empaquetado en una línea celular que proporciona los productos de E1 y E3 en trans (normalmente HEK293)

40 Vectores virales: Adenovirus
Ventajas Infectan un amplio rango de células de mamífero con elevada eficiencia Infectan tanto células en división como células que no se replican Elevados niveles de expresión de la proteína Se pueden obtener adenovirus en gran cantidad (adecuado para terapia génica) El ADN no se integra en el genoma por lo tanto no produce mutagénesis (epicromosómico) Se pueden utilizar en cultivos en suspensión (producción de proteína a gran escala) Sistema homólogo para genes humanos

41 Vectores virales: Adenovirus
Inconvenientes Limitación en el tamaño del inserto (7-8 kb) Expresión transitoria de la proteína Aplicaciones Transducción de ADN en células de mamífero para estudios de funcionalidad de proteínas Obtención de proteína recombinante por sobre-expresión en células humanas Terapia génica “in vivo”

42 Retrovirus Oncoretrovirus (retrovirus) Lentivirus
ej. Moloney Murine Leukemia Virus Sólo infectan células en división Lentivirus ej. HIV Infectan tanto células en división como quiescentes

43 Vectores virales: Retrovirus
Dos copias de ARN de cadena simple envuelto de proteína (ssRNA) Codifica por una transcriptasa reversa (RTase: RNA-dependent DNA polymerase) Sólo infecta a células en división Se integra en el genoma de la célula

44 Vectores virales: Retrovirus
Ciclo del retrovirus Infección célula diana Genoma RNA  copia DNA  transporte al núcleo Integración del ADN al cromosoma Transcripción DNA viral  mRNA Traducción mRNA  gag, pol, env Formación cápside: empaquetamiento de mRNAs/RTase Partículas virales liberadas

45 Vectores virales: Retrovirus
Construcción Vector Retroviral ¿Qué es imprescindible? 5’ LTR (promotor) y 3’ LTR (polyA) señal de empaquetamiento No se necesita: gag, pol, env estas proteínas las puede proporcionar la línia celular utilizada para la producción de los viriones

46 Vectores virales: Retrovirus
Construcción Vector Retroviral Promotor Gag- proteínas estructurales internas de la cápside Pol- Rtase, integrasa, proteasa Env- proteínas de la cápside Genoma retroviral Vector retroviral Promotor Tamaño máximo del inserto  8kb

47 Vectores virales: Retrovirus
Obtención de los Retrovirus Línea celular empaquetadora Producción de los retrovirus

48 Vectores virales: Retrovirus
Ventajas: Expresión estable de la proteína (integración del ADN al genoma) Puede infectar células de distintas especies (insectos, amfibios, peces, aves, mamíferos) Inconvenientes: Limitación tamaño inserto ( 8 kb) Dificultad de producción a gran escala de los retrovirus No infecta células que no se repliquen La inserción del ADN al genoma puede producir mutagénesis insercional Aplicaciones: Introducción de ADN en células en cultivo para obtener expresión estable Terapia génica “ex vivo”

49 Lentivirus Lentivirus is primarily a research tool used to introduce a gene product into in vitro systems or animal models. Large-scale collaborative efforts are underway to use lentiviruses to block the expression of a specific gene using RNA interference technology in high-throughput formats [1]. The expression of short-hairpin RNA (shRNA) reduces the expression of a specific gene, thus allowing researchers to examine the necessity and effects of a given gene in a model system. These studies can be a precursor to the development of novel drugs which aim to block a gene-product to treat a disease. Another common application is to use a lentivirus to introduce a new gene into human or animal cells. For example, a model of mouse hemophillia is corrected by expressing wild-type platlet-factor VIII, the gene that is mutated in human hemophillia [2]. Lentiviral infection have advantages over other gene-therapy methods including high-efficiency infection of dividing and non-dividing cells, long-term stable expression of a transgene, and low immunogenicity. Lentiviruses have also been successfully used for transfection of diabetic mice with the gene encoding PDGF (platelet-derived growth factor) [3], a therapy being considered for use in humans. These treatments, like most current gene therapy experiments, show promise but are yet to be established as safe and effective in controlled human studies. [edit] References

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52 Métodos de transfección de péptidos, proteínas o anticuerpos
Microinyección Electroporación Lípidos catiónicos BioPorter® (Genlantis) Pro-Ject (Pierce) “Carriers” de composición desconocida: Chariot (Active Motif) ProteoJuice  (Novagen) TransPass™ P (New England Biolabs) BioTrek™ Protein Delivery Reagent (Stratagene)

53 Aplicaciones Estudiar la función de la proteína introducida
Inhibir la actividad de una proteína celular endógena Analizar la distribución subcelular de la proteína introducida Realizar inmunodetección de proteínas en células vivas

54 BioPORTER Reagent

55 Pro-Ject Protein Transfection Reagent
Efficient protein delivery in hours instead of days. This is a unique cationic lipid mixture which, when complexed with proteins or peptides, allows direct intracellular delivery of proteins, peptides, antibodies and other biologically active molecules. Pro-Ject Protein Complexes attach to negatively charged cell surfaces and either can directly fuse with the membrane and deliver the captured protein into the cell or be endocytosed by the cell and then fuse with the endosome, releasing the captured protein into the cytoplasm (Figure 1). Since the complex formed is noncovalent it does not interfere with the protein's biological activity.

56 Chariot™ simple, efficient protein delivery
Chariot™* is a revolutionary delivery reagent that quickly and efficiently transports biologically active proteins, peptides and antibodies directly into cells. The typical delivery efficiency is 60-95%. Less than two hours after delivery, live cells can be assayed to determine the effects of the introduced material, without the need for fixing. This makes Chariot an ideal tool for functional studies, including delivering inhibitory proteins, labeling organelles, screening peptide libraries and studying protein half-lives & transient complementation. The Chariot™ Advantage Works in a variety of cell lines Facilitates functional studies in living cells — no fixing required Works in vivo (1) Fast and efficient — 60-95% transfection in less than 2 hours No need for expression of fusion proteins Non-cytotoxic, serum independent