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Tema 9. Sistemas de modificación celular Introducción Genes marcadores Técnicas de introducción de ADN en las células animales en cultivo Transfección.

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1 Tema 9. Sistemas de modificación celular Introducción Genes marcadores Técnicas de introducción de ADN en las células animales en cultivo Transfección Transfección Métodos químicos Métodos químicos Métodos físicos Métodos físicos Establecimiento de líneas de expresión estable Establecimiento de líneas de expresión estable Transducción: vectores virales Transducción: vectores virales Adenovirus Adenovirus Retrovirus y Lentivirus Retrovirus y Lentivirus Métodos de introducción de proteínas

2 Tema 9- Sistemas de modificación celular 2 Manipulación del cultivo celular para la modificación de la expresión y/o función de los genes. Ácidos nucleicos ADN: construcciones con la secuencia codificante del gen de interés,… ARN: puede ser codificante o regulador (RNAi o antisense) Proteínas: Proteínas: para evaluar su función o inhibirla con proteínas competidoras (dominante negativo) Anticuerpos: Anticuerpos: para neutralizar la función de una proteína

3 Tema 9- Sistemas de modificación celular 3 ¿Con qué finalidad queremos introducir ADN en una célula? Conferirle ventajas selectivas (ej. resistencia a una sustancia tóxica) Caracterizar la función de la proteína de interés Conocer la localización subcelular de una proteína (proteína marcada) Facilitar el estudio de la regulación de la expresión de un gen (región reguladora de la expresión del gen + gen marcador) proteína recombinante Obtener proteína recombinante procesada correctamente por células de mamífero

4 Tema 9- Sistemas de modificación celular 4 Condiciones ideales de introducción del ADN El método y las condiciones óptimos para cada tipo celular se tienen que establecer empíricamente Eficiencia máxima Toxicidad nula

5 Tema 9- Sistemas de modificación celular 5 Estrategias de introducción de ADN Transfección: Transfección: introducción del gen exógeno por métodos químicos o físicos Vector: plásmido de expresión Transducción o infección: Transducción o infección: introducción del gen exógeno mediante vectores virales Vector: material genético del virus

6 Tema 9- Sistemas de modificación celular 6 Transfección: vector Componentes de un plásmido de expresión de células de mamífero: 1.Origen de replicación en bacterias (ColE1): para mantener y amplificar el ADN 2.Gen de resistencia a un antibiótico (p.e. ampicilina): para seleccionar las bacterias que tienen el plásmido 1.Promotor secuencia que controla la expresión del transgen (p.e. pRSV expresión elevada y constitutiva) 2.Sitio de clonage: multi cloning site MCS (donde se introduce la secuencia de ADN de interés) 3.Señal de poliadenilación (finalización del ARN mensajero) 4.Gen de resistencia a un antibiótico para la selección de las células que han incorporado el plásmido en su genoma (p.e. Neomicina o Higromicina). Amplificación del vector en bacterias Expresión del gen en células de mamífero y selección de clones estables

7 Tema 9- Sistemas de modificación celular 7 Vector de expresión para células de mamífero MCS: MCS: multi cloning site Para amplificación y selección en bacterias Promotor Seq. de poliadenilación Promotor Gen de resistencia a la neomicina (selección en céls. mamífero) Seq. de poliadenilación

8 Tema 9- Sistemas de modificación celular 8 Permiten: Controlar la eficiencia de entrada del ADN Estudiar la regulación de la expresión de un gen Monitorizar la localización subcelular de la proteína Genes marcadores o reporter Aplicaciones: Normalización de los ensayos de expresión Seguimiento de una proteína marcada con un gen reporter Optimización de la metodología de introducción del ADN Codifican para proteínas de fácil detección

9 Tema 9- Sistemas de modificación celular 9 Genes reporter más comunes Chloramphenicol acetyl transferase (CAT) Enzima bacteriano que transfiere grupos acetilo del acetil-coenzima A al antibiótico cloranfenicol. El ensayo CAT se realiza con cloranfenicol radiactivo por lo que se detecta por autorradiografía. Luciferasa (luc) Enzima expresado en la luciérnaga Photinus pyralis. Cataliza la oxidación de las luciferinas, reacción que emite luz. La producción de luz se puede medir con un luminómetro. -galactosidasa ( -gal or lacZ) Enzima bacteriano muy versátil, su actividad se puede medir tanto en extractos celulares con un espectrofotómetro (aparición de producto coloreado) y por métodos histoquímicos con la aparición de un precipitado azul en las células que lo expresan.

10 Tema 9- Sistemas de modificación celular 10 Green fluorescent protein (GFP) El gen de esta proteína autofluorescente ha sido el gen marcador más útil para visualizar las células transfectadas in vivo. La GFP se obtuvo de la medusa Aequorea victoria. La exposición de la GFP a luz ultravioleta produce la emisión de una luz verde brillante en células vivas, sin la necesidad de añadir ningún sustrato o producto. En la actualidad se han clonado proteínas fluorescentes a partir de otras especies de medusa, anémonas y corales AmCyan1 ZsGreen1 ZsYellow1 DsRed1 AsRed2 HcRed1. Nuevas proteínas fluorescentes disponibles: Genes reporter más comunes

11 Tema 9- Sistemas de modificación celular 11 Métodos de Transfección 1.Métodos químicos: Se mezcla el ADN con moléculas cargadas positivamente que facilitan la entrada del ADN en la célula (moléculas portadoras o carrier) 2.Métodos físicos: Introducción del ADN de forma directa

12 Tema 9- Sistemas de modificación celular 12 Métodos de Transfección 1.Métodos químicos: Coprecipitación con fosfato cálcico DEAE-dextrano Lípidos catiónicos Polyethylenimine (PEI) 2.Métodos físicos: Electroporación Microinyección Biolistic Particle Delivery o Gene gun Magnetofección

13 Tema 9- Sistemas de modificación celular 13 eficiencia La eficiencia de transfección depende de la superación de varias barreras: 1) 1)adsorción del complejo de transfección en la superfície celular y entrada del complejo en la célula (membrana plasmática) 2) 2)liberación del ADN del endosoma y escape a la degradación lisosomal 3) 3)translocación a través de la membrana nuclear y entrada en el núcleo Barreras que tiene que superar el ADN

14 Tema 9- Sistemas de modificación celular Métodos químicos Coprecipitación con fosfato cálcico: precipitado de complejos fosfato cálcico-ADN que son endocitados por la célula ADN + CaCl 2 Añadir Na 2 PO 4 en tampón Precipitados de CaPO 4 con ADN endocitosis ADN + CaCl 2 Añadir Na 2 PO 4 en tampón Precipitados de CaPO 4 con ADN endocitosis

15 Tema 9- Sistemas de modificación celular Métodos químicos DEAE-dextrano (dietilaminoetil-dextrano): complejos de polímeros DEAE-dextrano y ADN, se introducen por shock osmótico con DMSO o glicerol Se utiliza solo en transfecciones transitorias.

16 Tema 9- Sistemas de modificación celular Métodos químicos Lípidos catiónicos: los liposomas catiónicos se acomplejan con el ADN y al fusionarse con la membrana celular, facilitan la entrada del ADN a través de endosomas Lipofección Este método recibe el nombre de Lipofección

17 Tema 9- Sistemas de modificación celular 17 Protocolo de Lipofección

18 Tema 9- Sistemas de modificación celular Métodos químicos Lípidos catiónicos: Alta eficiencia de transfección y baja toxicidad en determinados tipos celulares Gen marcador: -galactosidasa

19 Tema 9- Sistemas de modificación celular Métodos químicos PEI (polyethylenimine): Es un polímero catiónico sintético que genera complejos con el ADN. Estos complejos interaccionan con los proteoglicanos aniónicos de la membrana y entran por endocitosis

20 Tema 9- Sistemas de modificación celular Métodos químicos PEILípidos catiónicos Comparación entre dos métodos de transfección en células HEK293 Gen marcador: GFP (green fluorescent protein)

21 Tema 9- Sistemas de modificación celular 21 DNA transfection of various cell lines, including CHO-K1, COS-7, NIH3T3, HeLa S3, with CellLine Transfection Reagent 1. Métodos químicos Comparación de la eficiencia de la lipofección entre distintas líneas celulares

22 Tema 9- Sistemas de modificación celular 22 Factores que pueden influir en la eficiencia de Transfección Presencia de antibióticos El complejo puede interaccionar con el antibiótico disminuyendo la eficacia y aumentando la toxicidad Presencia de suero El suero puede disminuir la eficiencia de transfección Aunque la ausencia de suero puede hacer el liposoma más tóxico para las células

23 Tema 9- Sistemas de modificación celular Métodos físicos Microinyección: Microinyección: consiste en la inyección directa del ADN al citoplasma o núcleo de la célula Biolístico (biological ballistics): Biolístico (biological ballistics): implica la introducción de micropartículas de tungsteno u oro recubiertas con ADN con una pistola de helio. Electroporación: Electroporación: se basa en la generación de un shock eléctrico corto que origina pequeños orificios a la membrana que permiten la entrada del ADN. Elevada eficiencia, pero también elevada muerte celular Magnetofección: Magnetofección: utiliza nanopartículas magnéticas para facilitar la entrada del ADN en las células

24 Tema 9- Sistemas de modificación celular 24 Microinyección Introducción de soluciones de macromoléculas mediante capilares finos de vidrio que se manipulan bajo un microscopio.

25 Tema 9- Sistemas de modificación celular 25 Microinyección Limitaciones Dificultad técnica (requiere personal y instrumentación especializados) Manipulación individualizada de las células (elevado consumo de tiempo) Seguimiento individual de cada célula microinyectada Aplicaciones más corrientes: Microinyección de células adherentes en cultivo Generación de animales transgénicos (microinyección de ADN en el pronúcleo masculino del zigoto) Fecundación in vitro de oocitos (inyección de esperma en el citoplasma del oocito)

26 Tema 9- Sistemas de modificación celular 26 Biolistic particle delivery Método de transfección mediante bombardeo de las células con micropartículas de oro o tungsteno recubiertas con ADN o ARN. Helios Gene Gun - BioRad Aplicaciones: Recomendado para células resistentes a otros métodos y especialmente para células vegetales

27 Tema 9- Sistemas de modificación celular 27 Electroporación Introducción de macromoléculas en las células mediante la exposición a un pulso eléctrico de elevada intensidad y corta duración que provoca la apertura de poros en la membrana plasmática. Ventajas: Técnica simple, reproducible y de gran eficaciaDesventajas: Requiere desenganchar las células del sustrato Mucha mortalidad celular Se tienen que ajustar las condiciones para cada tipo celular

28 Tema 9- Sistemas de modificación celular 28 Electroporación Parámetros: Amplitud del pulso (Voltaje en kV/cm) Longitud del pulso (de seg a mseg) Normalmente las condiciones que permiten una mayor eficiencia de transfección provocan una muerte celular de entre el 40 y el 60% En la actualidad existen también sistemas de electroporación para células adheridas al sustrato y para realizar electroporaciones in vivo.

29 Tema 9- Sistemas de modificación celular 29 Magnetofección MATra - Magnet Assisted Transfection Utilización de nanopartículas magnéticas para mejorar la entrada de biomoléculas, como el ADN, dentro de las células.

30 Tema 9- Sistemas de modificación celular 30 Transfección transitoria: expresión de la proteína exógena durante un período corto (1 a 4 días). El ADN no se integra en el genoma de la célula. Transfección estable: permite la expresión de la proteína indefinidamente (en teoría). Se consigue mediante la selección de los clones que hayan incorporado el plásmido en su genoma (Tasa de inserción= 1 célula de cada 10000). Tipos de transfección

31 Tema 9- Sistemas de modificación celular 31 Ventajas Elevado nivel de expresión Es fácil co-expresar varias proteínas Procedimiento fácil y rápido Ventajas Población celular homogénea (clonal) Producción continua de proteína (teóricamente) Almacenamiento de células expresoras del transgen Transfección transitoria vs. Transfección estable Transfección transitoria Transfección estable Inconvenientes Variabilidad en el porcentaje de células expresoras (población celular heterogénea) Obtención de poca cantidad de proteína (producción temporal) Requiere gran cantidad de plásmido Inconvenientes Integración del transgen al azar en el genoma celular Niveles de expresión moderados Es complicado obtener la co-expresión de varias proteínas Procedimiento laborioso y largo de selección clonal

32 Tema 9- Sistemas de modificación celular 32 1/10000 céls. Colonias de células establesSe tripsinizan individualemente Se cultivan y amplifican para testar y caracterizar la expresión del gen Transfección Adición antibiótico 1 mes 2 días 1-2 semanas Muerte masiva células no estables 2 semanas 2 meses Clones estables: procedimiento de obtención

33 Tema 9- Sistemas de modificación celular 33 Sin selección muerte de células no expresoras crecimiento de los clones estables Cassettes de resistencia: NEO: Selección con G418 ( mg/ml) HYG: Selección con Higromicina-B ( mg/ml) PAC: Selección con puromicina (0.5-5 mg/ml) Estos antibióticos actuan inhibiendo la síntesis proteica Clones estables: selección con antibiótico Con selección aparición de clones resistentes

34 Tema 9. Sistemas de modificación celular Introducción Genes marcadores Técnicas de introducción de ADN en las células animales en cultivo Transfección Transfección Métodos químicos Métodos químicos Métodos físicos Métodos físicos Establecimiento de líneas de expresión estable Establecimiento de líneas de expresión estable Transducción: vectores virales Transducción: vectores virales Adenovirus Adenovirus Retrovirus y Lentivirus Retrovirus y Lentivirus Métodos de introducción de proteínas

35 Tema 9- Sistemas de modificación celular 35 Transducción: vectores virales AdenovirusRetrovirusLentivirus Herpes virus Adeno-associated virus

36 Tema 9- Sistemas de modificación celular 36 Vectores virales: Adenovirus Grupo de virus benignos, baja patogenicidad (ej. resfriado común) Genoma: ADN de doble cadena linear con una proteína unida covalentemente al extremo 5 (TP: terminal protein). Longitud aprox. 36 kb Simetria icosahédrica ( nm diámetro) Proteínas de la cápside: Hexon, penton base, fibra globular

37 Tema 9- Sistemas de modificación celular 37 Vectores virales: Adenovirus Ciclo del Adenovirus Entran mediante la unión (alta afinitat) a receptores específicos de la célula diana mediada por el extremo globular de la fibra Endocitosis del virus Sale del endosoma y transloca al núcleo El ADN viral entra en el núcleo y empieza la transcripción La transcripción, la replicación y el empaquetado tienen lugar dentro del núcleo de la célula infectada.

38 Tema 9- Sistemas de modificación celular 38 Vectores virales: Adenovirus Genoma del Adenovirus Se transcriben las dos cadenas de ADN Transcripción en dos fases: Early: Early: E1, E2, E3 i E4 (antes de la replicación del ADN) Late: Late: (después de la replicación del ADN)

39 Tema 9- Sistemas de modificación celular 39 Vectores virales: Adenovirus Vector Adenoviral Virus deficientes en la replicación- deleción de las regiones E1 (esencial para la replicación) y E3 (modulación respuesta immune huésped). El inserto puede ser de 7 a 8 kb (gene-X) Empaquetado en una línea celular que proporciona los productos de E1 y E3 en trans (normalmente HEK293)

40 Tema 9- Sistemas de modificación celular 40 Vectores virales: Adenovirus Ventajas Infectan un amplio rango de células de mamífero con elevada eficiencia Infectan tanto células en división como células que no se replican Elevados niveles de expresión de la proteína Se pueden obtener adenovirus en gran cantidad (adecuado para terapia génica) El ADN no se integra en el genoma por lo tanto no produce mutagénesis (epicromosómico) Se pueden utilizar en cultivos en suspensión (producción de proteína a gran escala) Sistema homólogo para genes humanos

41 Tema 9- Sistemas de modificación celular 41 Vectores virales: Adenovirus Inconvenientes Limitación en el tamaño del inserto (7-8 kb) Expresión transitoria de la proteínaAplicaciones Transducción de ADN en células de mamífero para estudios de funcionalidad de proteínas Obtención de proteína recombinante por sobre- expresión en células humanas Terapia génica in vivo

42 Tema 9- Sistemas de modificación celular 42 Oncoretrovirus (retrovirus) ej. Moloney Murine Leukemia Virus Sólo infectan células en división Lentivirus ej. HIV Infectan tanto células en división como quiescentes Retrovirus

43 Tema 9- Sistemas de modificación celular 43 Vectores virales: Retrovirus Dos copias de ARN de cadena simple envuelto de proteína (ssRNA) RTase: Codifica por una transcriptasa reversa (RTase: RNA-dependent DNA polymerase) Sólo infecta a células en división Se integra en el genoma de la célula

44 Tema 9- Sistemas de modificación celular 44 Vectores virales: Retrovirus Ciclo del retrovirus Infección célula diana Genoma RNA copia DNA transporte al núcleo Integración del ADN al cromosoma Transcripción DNA viral mRNA Traducción mRNA gag, pol, env Formación cápside: empaquetamiento de mRNAs/RTase Partículas virales liberadas

45 Tema 9- Sistemas de modificación celular 45 Vectores virales: Retrovirus Construcción Vector Retroviral ¿Qué es imprescindible? 5 LTR (promotor) y 3 LTR (polyA) señal de empaquetamiento No se necesita: gag, pol, env estas proteínas las puede proporcionar la línia celular utilizada para la producción de los viriones

46 Tema 9- Sistemas de modificación celular 46 Vectores virales: Retrovirus Promotor Gag- proteínas estructurales internas de la cápside Pol- Rtase, integrasa, proteasa Env- proteínas de la cápside Genoma retroviral Vector retroviral Promotor Tamaño máximo del inserto 8kb Construcción Vector Retroviral

47 Tema 9- Sistemas de modificación celular 47 Vectores virales: Retrovirus Obtención de los Retrovirus Línea celular empaquetadora Producción de los retrovirus

48 Tema 9- Sistemas de modificación celular 48 Vectores virales: Retrovirus Ventajas: Expresión estable de la proteína (integración del ADN al genoma) Puede infectar células de distintas especies (insectos, amfibios, peces, aves, mamíferos)Inconvenientes: Limitación tamaño inserto ( 8 kb) Dificultad de producción a gran escala de los retrovirus No infecta células que no se repliquen La inserción del ADN al genoma puede producir mutagénesis insercionalAplicaciones: Introducción de ADN en células en cultivo para obtener expresión estable Terapia génica ex vivo

49 Tema 9- Sistemas de modificación celular 49 Lentivirus

50 Tema 9- Sistemas de modificación celular 50

51 Tema 9- Sistemas de modificación celular 51

52 Tema 9- Sistemas de modificación celular 52 Métodos de transfección de péptidos, proteínas o anticuerpos Microinyección Electroporación Lípidos catiónicos BioPorter® (Genlantis) Pro-Ject (Pierce) Carriers de composición desconocida: Chariot (Active Motif) ProteoJuice (Novagen) TransPass P (New England Biolabs) BioTrek Protein Delivery Reagent (Stratagene)

53 Tema 9- Sistemas de modificación celular 53 Aplicaciones Estudiar la función de la proteína introducida Inhibir la actividad de una proteína celular endógena Analizar la distribución subcelular de la proteína introducida Realizar inmunodetección de proteínas en células vivas

54 Tema 9- Sistemas de modificación celular 54 BioPORTER Reagent

55 Tema 9- Sistemas de modificación celular 55 Pro-Ject Protein Transfection Reagent Efficient protein delivery in hours instead of days. This is a unique cationic lipid mixture which, when complexed with proteins or peptides, allows direct intracellular delivery of proteins, peptides, antibodies and other biologically active molecules. Pro- Ject Protein Complexes attach to negatively charged cell surfaces and either can directly fuse with the membrane and deliver the captured protein into the cell or be endocytosed by the cell and then fuse with the endosome, releasing the captured protein into the cytoplasm (Figure 1). Since the complex formed is noncovalent it does not interfere with the protein's biological activity.

56 Tema 9- Sistemas de modificación celular 56 Chariot simple, efficient protein delivery Chariot* is a revolutionary delivery reagent that quickly and efficiently transports biologically active proteins, peptides and antibodies directly into cells. The typical delivery efficiency is 60-95%. Less than two hours after delivery, live cells can be assayed to determine the effects of the introduced material, without the need for fixing. This makes Chariot an ideal tool for functional studies, including delivering inhibitory proteins, labeling organelles, screening peptide libraries and studying protein half-lives & transient complementation. The Chariot Advantage Works in a variety of cell lines Facilitates functional studies in living cells no fixing required Works in vivo (1) Fast and efficient 60-95% transfection in less than 2 hours No need for expression of fusion proteins Non-cytotoxic, serum independent


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