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Leucemia linfática crónica B Leucemia linfática crónica B: una enfermedad heterogénea. Estudio del rol de las mutaciones de IgV H y BCL-6 en esta heterogeneidad.

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1 Leucemia linfática crónica B Leucemia linfática crónica B: una enfermedad heterogénea. Estudio del rol de las mutaciones de IgV H y BCL-6 en esta heterogeneidad. Aproximaciones genómica y funcional. Leucemia linfática crónica B Leucemia linfática crónica B: una enfermedad heterogénea. Estudio del rol de las mutaciones de IgV H y BCL-6 en esta heterogeneidad. Aproximaciones genómica y funcional. Eloisa Jantus Lewintre HOSPITAL UNIVERSITARIO LA FE SERVICIO HEMATOLOGIA 2 de Octubre de 2008

2 INTRODUCCIÓN

3 leucemia linfática crónica B La leucemia linfática crónica B (LLC-B) se define como: Enfermedad causada por la acumulación progresiva monoclonal de células B que co-expresan CD5+ y CD19+, originada a partir de linfocitos B maduros con experiencia antigénica. Actualmente se la describe como una enfermedad por acumulación de células B con un alto nivel de proliferación, mientras que anteriormente se creía que se debía a un defecto en la apoptosis de células inmuno-incompetentes. Curso clínico variable: Grupo de pacientes con enfermedad agresiva con necesidad de tratamiento Grupo de pacientes con enfermedad indolente Se presenta en edad avanzada (10-15% en < 50 años) Afecta más a hombres que a mujeres (1.5 : 1.0 ). LLC-B: GENERALIDADES

4 Desarrollo de Linfocitos B normales CD10 CD19 CD34 CD10 CD19 CD34 CD10 CD19 CD34 Pro B Pre B BCR Cel B inmadura M.O. D9J4 V3

5 Vías de maduración de las células B: dependencia de células T Chiorazzi N, N Engl J Med 2005 BCL6 mutations AID

6 Mutado No Mutado Estim. antigénica Selección por antígeno Lesión genética LLC clon mutado LLC clon no mutado Desarrollo y evolución de las células de LLC-B HETEROGENEIDAD

7 FACTORES PRONÓSTICO EN LLC Estadíos de Binet o Rai Tiempo duplicación linfocitario Timidina-kinasa 2 microglobulina LDH Patrón histopatológico de médula ósea. Estado mutacional de IgV H Mutaciones en región 5 no-codificante del gen BCL6 Expresión de CD38 Expresión de ZAP-70 Alteraciones citogenéticas (del 17p, del11q, del 13q, +12)

8 Hamblin TJ,. Blood years MUTACIONES SOMÁTICAS EN IgV H y BCL6 year s MESES ,0,8,6,4,2 0,0 GRUPOS GRUPO I BCL6 + / IgVH+ GRUPO II BCL6 - / IgVH + GRUPO III BCL6 - / IgVH - Sarsotti E, Leukemia.2004 ILT No se pueden determinar de rutina en diagnóstico

9 EXPRESIÓN DE ZAP70 y CD38

10 OBJETIVO PRINCIPAL OBJETIVO PRINCIPAL Valorar la implicación de las mutaciones en los genes IgV H y BCL-6 como responsables de la heterogeneidad en el comportamiento biológico y expresión génica en la LLC-B e identificar nuevos marcadores subrogados de las mutaciones en IgV H y de pronóstico en estadíos tempranos de la enfermedad HIPOTESIS LLC: formas clínicas heterog. Subgrupos moleculares Influyen en evolución y necesidad de tratamiento (ptes en estadío A) Perfiles genómicos y funcionales DIFERENTES?

11 CAPÍTULO I: ESTUDIOS FUNCIONALES OBJETIVOS: 1.Evaluar el estado mutacional de IgV H en muestras de LLC mediante protocolo Biomed2 modificado y valorar su utilidad 2.Secuenciar la región 5 no codif del gen BCL6 y correlacionar polimorfismos y mutaciones en esta región con expresión. 3.Realizar estudios de quimiosensibilidad in vitro con Btz y correlacionarlos con el estado mutacional de los genes IgV H y BCL6

12 LLC-B: diagnóstico NCI 1996 [Cheson, Blood,1996] N=74 Edad mediana: 67,4 años (42-86) Inmunofenotipo, CD38, ZAP70 por FC Alteraciones citogenéticas (FISH) Estadío A de Binet 56.7% varones Otros: score, TDL, LDH, 2microglob

13 CDR1 CDR2 N N Dominio variable Dominio constante CDR2CDR3CDR1 VD J mRNA (gen) Ig, cadena pesada (proteína) CDR3 Dominio variable ESTADO MUTACIONAL DEL GEN IgV H 6 VH-Leader Homología <98% MUT >98% NO-MUT

14 CARACTERIZACIÓN DE LAS MUTACIONES EN IgV H VHFamiliaIgV H mutado IgV H No mutado VHFamiliaIgV H mutado IgV H No mutado VH3 44 % 3-76 VH1 24 % TOTAL VH4 19% TOTAL VH2 8% VH5 3% VH6 1.3% 6-11 TOTAL267 Mutadas= 54 (73%) No mut= 20 (27.0%)

15 Representación esquemática del gen BCL-6. Los exones codificantes y no codificantes se representan por rectángulos llenos y vacíos, respectivamente. La región que sufre SHM y que hemos analizado aparece indicada por una línea azul. ESTADO MUTACIONAL DEL GEN BCL6 E1.21C (sentido): CTC TTG CCA AAT GCT TTG E1.24 (antisentido): TAA TTC CCC TCC TTC CT E1.23 (sentido): AGG AAG GAG GGG AAT TAG E1.P1.6 (antisentido): AAG CAG TTT GCA AGC GAG E1.P1.7(sentido): TTC TCG CTT GCA AAC TGC E1.26 (antisentido) CAC GAT ACT TCA TCT CAT C E1.10 E1.11 E1.12 E1.21C E pb

16 ESTUDIO DE LA REGION 5 DEL GEN BCL6 N=69 100% IgV H mut 20 mutadas (29%) 34 mutaciones 31 mutac. diferentes Sustit. nucleót. C (35.3%) T (29.4%) G (26.5%) MUTACIONES POLIMORFISMOS delT 520 (29.0%) 397 G>C (17.4%) 502 G>A (7.2%)

17 Posición Frecuencia de mutaciones MUTACIONES DEL GEN BCL6

18 BCL6: RELACIÓN ENTRE MUTACIONES Y EXPRESIÓN Prueba estadística: Pearson

19 BAY BORTEZOMIB Stress oxidativo, Citoquinas (CD40 L, IL-4, IL-1, TNFa, otros) Infeccion viral/ bacteriana BCL2 Btz Control 24 hs 37ºC 5% CO2 CULTIVOS CELULARES RPMI 15% FBS APOPTOSIS Anexina V + PI

20 Inducción de apoptosis por Btz en células con IgV H mutado: correlación con mutaciones en BCL-6. TratamientoCélulas con IgV H mutado: Mutaciones en BCL-6 n% Apoptosis (media SEM) p* Btz 0.1 M IgV H mut/ BCL-6 no-mut IgV H mut/ BCL-6 mut Btz 1.0 M IgV H mut/ BCL-6 no-mut IgV H mut/ BCL-6 mut

21 CAPÍTULO II: ESTUDIOS GENÓMICOS OBJETIVOS: 1.Estudiar la firma molecular de la LLC-B mediante el uso de micromatrices de alta densidad, identificando vías metabólicas o términos de ontología génica que estuvieran sobrerepresentados en esta patología. 2.Estudiar el perfil de expresión génica en distintos grupos moleculares de LLC-B con el fin de identificar genes y vías metabólicas diferencialmente expresados. 3.Validar los resultados obtenidos del estudio transcriptómico mediante RTqPCR.

22 Células B seleccionadas Células B seleccionadas ( CD19+ bolas inmunomagnéticas) 11 Controles sanos 36 muestras LLC-B estadío A de Binet (no tratados) * 24 IgV H mutado15 BCL6 no mutado (G1) 9 BCL6 mutado (G2) * 12 IgV H no mutado (G3) CD19 Grupo INICIAL Micromatrices Validación metodolog. por RTqPCR IgV H mut=24 BCL6mut=9 IgV H no mut= 12 N=36 LLC-B: estadío A

23 METODOLOGÍA GENÓMICA Extracción de ARN total de linf B Hibridación con Micromatrices de ADN (microarrays, chips) Human Genome U133 Plus 2.0 (Affymetrix) Transcripción a ADNc Marcaje con fluorescencia Suite GEPAS Montaner D, Nucleic Acids Res, 2006, 34:W Datos 1.Preprocesamiento: Normalización, QC 2.Cluster jerárquico 3.Expresión diferencial (estudio supervisado) -> prueba t 4.Estudio de Anotación Funcional -> FatiScan

24 CONTROLESvsLLC

25 LLC-B Cluster jerárquico – Método UPGMA

26 ASXL2 NEDD8 GLIPR1 SMAD3 POLB FIRMA MOLECULAR LLC-B HG U Plus (Affymetrix) GLIPR1 POLR3B POLR2L ASXL2 NEDD8 SCLY RAD51L1 RBM14 POLE4 ERCC1 Repar. y replic. ADN SIGLEC10 CLSTN1 HLADOB FCRL5 Proteína integr. membr. Proteína relacionada a patogén. en gllioma ->pro apoptotica en Ca de próstata y vejiga Polimerasas involucr. en transcrip. Gen asociado a carcinogen. Codif proteina similar a ubiquitina ->ciclo celular, embriogen. Factor de transcrip esencial p/ todos los linajes hematopoy.

27 ANÁLISIS FUNCIONAL: FatiScan ACTIVADOS EN LEUCEMIA REPRIMIDOS EN CONTROLES ACTIVADOS EN CONTROLES REPRIMIDOS EN LEUCEMIA - Sínt de ATP acopl a transp de electrones - Replicación ADN - Recombinación ADN - Reparación ADN - Metabol. de nucleótidos - Metabol. de hexosas - Ciclo celular - Fosforilación oxidativa - Vía de las pentosas fosfato - Ciclo del citrato - Muerte celular- Diferenciación celular - Apoptosis - Proteólisis mediada por ubiquitina GO KEGG GO KEGG

28 G1 + G2 (IgV H mut) vs G3 (IgV H no mut)

29 LPL: enzima del metabolismo lipídico. Formación y estabiliz de lipid raft en LLC BC7A ( B-cell CLL/lymphoma 7A) involucrado en traslocaciones cromosóm. en linfomas no Hodgkin CD82: gen supresor de metástasisDUSP22: fosfatasa dual. Activa vía JNKBCL11A: prot dedo de Zn, expresada en CG MGC9913 RGS4 CRY1 DMD BCL7A LPL TUBA8 ITGA9 BCL11A DUSP22 PDLIM5 SVH ADAM29 CD82 FUT8 CRY1: componente del reloj circadiano

30 ANÁLISIS FUNCIONAL: FatiScan G1 + G2 (IgV H mut) vs. G3 (IgV H no mut) ACTIVADOS EN IgV H no mut REPRIMIDOS EN IgV H mut ACTIVADOS EN IgV H mut REPRIMIDOS EN IgV H no mut - Señalización vía proteina G - Procesos rítmicos - Vía de señalización Frizzled-2 (WNT) - Vía de señalización mediada por Ca - Interacc ECM- receptor - Vía de señalización Hedgehog - Uniones tipo Gap - Regulac positiva de IkB kinasa - Metabol glicerolipídico - Ribosoma - Apoptosis GO KEGG GO - Adhesión celular homofílica KEGG GO

31 Expresión diferencial - FatiScan G1 (IgV H mut/ BCL6 no mut) vs. G2 (IgV H mut/ BCL6 mut) No hay genes expresados significativamente de manera diferencial

32 MET. DE VALIDACIÓN: PCR cuantitat. a tiempo real Genes validados (N=14) Valor Expresión Normalizado= E T CpT(C)-CpT(S) x E R CpR(S)-CpR(C) E T = Efic.del gen diana E R = Efic. del gen de referencia C pT ciclo umbral del gen diana C pR ciclo umbral del gen de referencia C=Calibrador ; S= muestra

33 Validación de resultados: Cuantificación de mRNA por RTqPCR * No signif. estadíst. en datos de micromatrices

34 CAPÍTULO III: MARCADORES PRONÓSTICO EN LLC-B OBJETIVOS: 1.Validar biológicamente los marcadores identificados en un grupo muestral independiente. 2. Valorar la utilidad de los genes seleccionados como marcadores subrogados del estado mutacional de IgV H y de pronóstico en estadíos tempranos de la LLC-B

35 Grupo INICIAL Micromatrices Validación metodolog. por RTqPCR IgV H mut=24 BCL6mut=9 IgV H no mut= 12 N=36 Grupo VALIDACIÓN Validación BIOLÓGICA RTqPCR N=38 IgV H mut=30 BCL6mut=11 IgV H no mut= 8 N=74 Marcador Subrogado IgV H IgV H mut=54IgV H no mut= 20 Marcador Pronóstico (ILT) LLC-B: estadío A

36 Correlación entre expresión relativa y estado mutacional de IgV H en muestras del grupo de validación IgV H Gen No mut (media + 2SEM) Mut (media + 2SEM) p (prueba de Mann Whitney) CRY <0.001 LPL <0.001 BCL7A <0.001 ZAP <0.001 CD DUSP

37 Marcadores subrogados de IgV H Sensibilidad, especificidad, y área bajo la curva ROC en grupo de validación en grupo de validación

38 Expresión de genes seleccionados y estado mutacional del gen IgV H N N o o M M u u t t M M u u t t C C o o n n c c o o r r d d a a n n c c i i a a G G e e n n V V a a l l o o r r d d e e c c o o r r t t e e n % n % % p (Chi cuadrado) > CRY1 < < > LPL < < > ZAP70 < < < BCL7A > <0.0001

39 CRY1 y LPL como marcadores subrogados del estado mutacional de IgV H Las barras de error representan el 95% del intervalo de confianza. La línea roja muestra el valor de corte para cada parámetro A B A B No mut Mut IgV H

40 La significación estadística de las diferencias entre curvas fue evaluada por la prueba Log-rank. Curvas de Kaplan-Meier: Mutaciones en IgV H Actualm. usado en clínica.

41 Curvas de Kaplan-Meier: LPL, CRY1 y ZAP70 N=71 CRY1 p< LPL ZAP70- RTqPCR p=0.001

42 CRY1: ¿NUEVO BIOMARCADOR EN LLC-B? Correlación con la expresión de ZAP70 o LPL y estado mutacional de IgV H CRY1 +CRY1 - ZAP70 qPCR ZAP70 qPCR CRY1 +CRY1 - LPL LPL IgV H No mut 3 IgV H Mut 2= ZAP70 FC+ CD IgV H Mut 20 IgV H No mut 1 IgV H Mut 1= ZAP70 FC+ CD IgV H Mut 9 IgV H Mut 1 IgV H No mut 1 IgV H Mut CD38+ 4 IgV H Mut 1 IgV H No mut 2 IgV H Mut 15.5% discordancias 10.0% discordancias

43 CRY1: Expresión en PBMC Gen IgV H P (prueba de Mann Whitney) No mut (media + 2 SEM) Mut (media + 2 SEM) CRY IgV H MARCADOR SUBROGADO IgV H Ensayo Clínico N=18 sin selección de células B

44 CONCLUSIONES

45 1.Los estudios funcionales y de expresión génica que hemos realizado sobre muestras de pacientes en estadíos tempranos de LLC, demuestran la heterogeneidad de esta entidad y manifiestan la existencia de subgrupos moleculares bien definidos dentro de esta patología. 2.Mas de un centenar de genes diferencian los perfiles transcriptómicos de muestras con y sin mutaciones en el gen IgV H, en cambio no se encuentran diferencias en los perfiles de expresión con respecto a las mutaciones en BCL6. 3.En el análisis de anotaciones funcionales, la herramienta FatiScan encuentra en las muestras con IgV H no mutado sobreexpresadas vías de señalización involucradas en supervivencia y proliferación celular provenientes del entorno y de la matriz extracelular e inhibida la apoptosis. 4.Existen varios genes cuya expresión podría utilizarse como marcador subrogado del estado mutacional de IgV H y de pronóstico en LLC-B, siendo el gen CRY1, uno de los que proponemos para ser incorporado en ensayos clínicos y posiblemente en la práctica clínica.

46 Hospital Clínico Javier García Conde Ma Jose Terol Isana Benet Pilar Eroles Isabel Marugan Elena Sarsotti Miguel MarínCIPF Hematología Molecular Rosa Farras Cristina Reinoso Sandra GallachCIPFBioinformática Joaquín Dopazo David Montaner Hospital Arnau de Vilanova Jose Ramón Mayans Carlos García Ballesteros

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