NORTHERN BLOT.

Presentación del tema: "NORTHERN BLOT."— Transcripción de la presentación:

1 NORTHERN BLOT

2 NORTHERN BLOT Es una técnica de detección de moléculas de ácido ribonucleico (ARN) de una secuencia dada dentro de una mezcla compleja. Este método se utiliza muy frecuente para realizar estudios de expresión génica. El procedimiento usado en el Northern bloot es exactamente el mismo que el del Southern bloot , con la diferencia de que el Northern bloot busca secuencias en el ARN en vez del ADN

3 La técnica consiste en extraer el RNA de las células pertinentes y su posterior separación por tamaño mediante electroforesis en gel. Las moléculas de RNA son transferidas y unidas al filtro, al igual que en el Southern blot. Después de la hibridación con una sonda marcada (y posterior a la detección según el método de marcaje utilizado), las bandas en el gel indican la ubicación de los tipos de RNA que sean complementarios a la sonda. Teniendo marcadores de RNA de tamaño adecuado, se puede conocer el tamaño de los RNA que se han identificado.

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5 1.Extraccion del RNA Se extrae una muestra de ARN ,“debe tenerse mucho cuidado para impedir la degradación por las ribonucleasas (ARNasas )para esto las células y tejidos que contienen ARN se homogenizan en una solución que contenga inhibidores de ARNasas , como el agente enofropico isotiacianato de guanidinio. Lisis con tiocianato de guanidina → inactivación de RNasas. Partición de DNA, RNA y proteínas en fenol ácido (pH 5-6). Precipitación con isopropanol + LiCl2.

6 Luego se separa el ADN del ARN y finalmente el ARN purificado se precipita con etanol. Para el caso del ARN mensajero se aprovecha la propiedad de que posea cola de poli-A; en el primer paso el ARN celular total se pasa por una columna que posee poli-dT unido a una fase sólida quedando el ARN retenido en fase sólida cuando se únela poli-dT quedando excluido el resto de ARN celular. Se desnaturalizan la muestra, a menudo la totalidad del ARN celular, mediante tratamiento con un agente que puede ser formamida o glioxal, que impide unión por puente de hidrógeno entre los pares de bases, lo cuál asegura que todas las moléculas de ARN presenten una conformación lineal no plegado.

7 2.Electroforesis Se separan los ARN de acuerdo con su tamaño, mediante electroforesis en gel. La electroforesis es un método de laboratorio en el que se utiliza una corriente eléctrica controlada con la finalidad de separar biomoléculas según su tamaño y carga eléctrica a través de una matriz gelatinosa. Se usa la electroforesis en gel de agarosa

8 3.Transferencia a una membrana

9 Existen 2 tipos de membranas
a) NITROCELULOSA • baja capacidad de unión de ácidos nucleicos (80 μg/ cc2) • frágil • carga negativa b) NYLON • mayor capacidad de unión ( μg/cc2 ) • mayor resistencia • carga neutra o positiva

10 Es necesario inmovilizar el RNA en la membrana y esto se puede conseguir a través de dos maneras: a) Horno de vacío Aplicable sólo a membranas de nitrocelulosa La membrana es tratada por 2 horas a 80 ºC. Al parecer el RNA forma enlaces hidrofóbicos con la membrana. b) Irradiación UV Aplicable sólo a membranas de nylon La exposición a la luz UV activa las bases T/U haciéndolas altamente reactivas con los grupos amino de la superficie de la membrana y formando enlaces covalentes. Aumenta la estabilidad y permanencia de los ácidos nucleicos en la membrana

11 4.GENERACION DE UNA SONDA
Las sondas son fragmentos monocatenarios de DNA o RNA marcados con una molécula reporter, que pueden ser enzimas, sustratos antigénicos, radioisótopos, los que se pueden unirse con una alta especificidad a una secuencia complementaria de ácido nucleico de cadena sencilla (diana), a fin de hacer posible su posterior detección y de esta manera la identificación de la secuencia de ARN de interés.

12 5.Hibridacion Éste es un proceso de complementación de pares de bases entre dos hebras sencillas de ADN y ARN, o ARN s pero cuyo origen es distinto; cuyo fin principal es conseguir la máxima interacción entre la sonda y la molécula de ácido nucleico que se quiere detectar. PROCEDIMIENTO La hibridación se lleva a cabo en tres etapas: a) Pre –Hibridación b) Hibridación c) Lavados

13 Pre Hibridación o bloqueo ¿Por qué
Pre Hibridación o bloqueo ¿Por qué? – La membrana une ácidos nucleicos ,la sonda marcada puede unirse de forma inespecífica y aumentar el ruido • ¿Cómo? – La membrana es incubada con una solución de prehibridación a la temperatura de hibridación. – La solución de pre-hibridación contiene compuestos que se unen inespecíficamente a la membrana previniendo la unión de la sonda a regiones de la membrana que no contienen su hebra complementaria.

14 Hibridación Se expone el filtro a una zona de ADN con marca radiactiva con la cuál se produce una hibridación ya que dicha sonda es complementaria al ARN. La cadena de mRNA que se quiere cuantificar se une con la sonda complementaria se hibridizan de forma antiparalela, para forman una molécula de doble cadena. Esto se logra sumergiendo la membrana de fijación en un buffer que contiene la sonda. Lavado Al final del período de hibridización, se debe retirar el buffer de hibridización y lavar los filtros para remover la sonda que está en exceso, unida de manera inespecífica o unida con poca complementariedad. Esto se lleva a cabo incubando la membrana en una solución que carece de sonda marcada y utilizando condiciones que minimizan la hibridación inespecífica(Estrictez)

15 *ESTRICTEZ Una medida de la habilidad de un ac.nucleico de hebra simple (sonda) de discriminar entre moléculas con las que comparte un alto o un bajo grado de complementariedad Para lograr una meyor estrictezse debe aumentar la Tº,incluir formamida,etc

16 6.Visualizacion Captura de la radiación ionizante por una emulsión
fotográfica • La membrana es expuesta a un film por tiempos variables • El film es revelado y analizado

17 APLICACIONES Esta técnica se ha aplicado en:
Se utiliza para detectar la presencia de moléculas específicas de ARN en una muestra específica. Proporciona información sobre moléculas que hibridan. Por ejemplo, su tamaño molecular. 3.Se usan generalmente para caracterizar la identidad de genes específicos, para localizar regiones codificantes o regiones reguladoras flanqueantes en secuencias clonadas. Por ende, sirve para investigar la organización molecular de las secuencias genómicas. 4.Se utiliza para examinar patrones de expresión génica en tejidos embrionarios y en adultos. 5.En la detección de cortes y empalmes alternativos del ARNm. 6.También se aplica en la detección de múltiples tipos de transcritos proveniente de un solo gen. La transferencia de NORTHERN se utiliza también para caracterizar y cuantificar la actividad transcripcional de un gen determinado en distintas células, tejidos u organismos. Es de suma importancia en el estudio de la modulación de la síntesis de interleucina 6 en pacientes con artritis reumatoide. De su análisis se rescata la secuencia y organización molecular. Es indispensable en el análisis de expresión de receptores que participan en la síntesis de moléculas en cultivos celulares.

18 5.En la detección de cortes y empalmes alternativos del ARNm.
6.También se aplica en la detección de múltiples tipos de transcritos proveniente de un solo gen. 7.La transferencia de NORTHERN se utiliza también para caracterizar y cuantificar la actividad transcripcional de un gen determinado en distintas células, tejidos u organismos. 8.Es de suma importancia en el estudio de la modulación de la síntesis de interleucina 6 en pacientes con artritis reumatoide. 9.De su análisis se rescata la secuencia y organización molecular. 10.Es indispensable en el análisis de expresión de receptores que participan en la síntesis de moléculas en cultivos celulares.

19 VENTAJAS Y DESVENTAJAS
VENTAJAS Y DESVENTAJAS Ventajas -La muestra de ARN requiere un mínimo de procesamiento. -La técnica puede ser fácilmente evaluada (degradación, límite de detección). -Nos permite reconocer el análisis de mutaciones y alteraciones del RNAm de enzimas, y en la regulación de la expresión génica de marcadores moleculares de células leucémicas humanas y moléculas del reconocimiento inmunológico. DESVENTAJAS -El costo elevado de su elaboración. -La reproducibilidad de los datos no siempre es consistente. Este problema se ha resulto parcialmente haciendo mediciones por duplicado (dos puntos en la matriz que corresponden al mismos gen). -Su resultado depende de la sonda que se utilice, de las propiedades químicas de esta. -Se requiere mucha masa de ARN (se requieren aproximadamente 20ug de ARN total).