Electroforesis o cataforesis

Presentación del tema: "Electroforesis o cataforesis"— Transcripción de la presentación:

1 Electroforesis o cataforesis
Es el movimiento de moléculas o partículas cargadas en un campo eléctrico Se puede realizar con propósitos analíticos de identificación o para caracterización física de los componentes de una muestra o para su separación preparativa. Se usa para analizar y separa moléculas (ej. proteínas) o para depositar recubrimientos, como en los elementos usados en los tubos de electrones.

2 Electroforesis o cataforesis
La migración electroforética de una molécula puede realizarse dentro de cualquier medio pero generalmente es una matriz. Si el fluido es el que se pone en movimiento, por ejemplo a través de un diafragma fijo, se le llama electroósmosis.

3 Movimiento de moléculas en la electroforesis
Las moléculas siempre se mueven hacia el electrodo de polaridad opuesta a la carga neta de la molécula (los cationes se mueven hacia el cátodo y los aniones hacia el ánodo). El medio necesita estar amortiguado al pH que produce la dirección y taza apropiada de migración.

4 Electroforesis cátodo – (–) – – + + – + – – (+) ánodo

5 Movilidad y pI Las movilidades de las proteínas se incrementan proporcionalmente al alejamiento de sus puntos isoeléctricos ya que se incremente su carga neta. Los ácidos nucleicos y las proteínas en presencia de SDS presentan movilidades más altas en un rango de pH arriba de la neutralidad.

6 Factores que afectan la movilidad electroforética
Composición del solvente Presencia de detergentes Temperatura Fuerza iónica Ejemplos: la estabilidad de los ácidos nucleicos depende de los iones Na+ Las proteínas se agregar a bajas fuerzas iónicas Altas fuerzas iónicas pueden sobrepasar la disipación de calor de Joule del aparato de electroforesis

7 Invención El primer aparato sofisticado de electroforesis fue desarrollado por Tiselius en 1937 Desarrolló la “moving boundary”, que se convertiría en la electroforesis zonal y la utilizó para separar proteínas del suero.

8 Arne Wilhelm Kaurin Tiselius (1902-71)
Tesis (1930): The moving-boundary method of studying the electrophoresis of proteins" (publicado en Nova Acta Regiae Societatis Scientiarum Upsaliensis, Ser. IV, 7, No. 4) (1937) A new apparatus for electrophoretic analysis of colloidal mixtures. Transactions of the Faraday Society,

9 Tubo de Tiselius + – Ánodo Cátodo Amortiguador
Límite o frontera ascendente Fronteras iniciales Límite o frontera descendente Arne Tiselius introdujo el uso de la electroforesis como técnica analítica. Tiselius diseñó el método de observación del límite o frontera móvil en el que una capa de fluido puro (sin partículas) se coloca sobre una cantidad de líquido que contiene partículas coloidales, la frontera entre las dos capas de líquido puede observarse y se mueve a la velocidad de electroforesis de las partículas. Moléculas de proteína

10 Desarrollo La electroforesis se desarrollo completamente de los años 40s a los 50s. Se utilizó para separar moléculas que van desde las proteínas más grandes, aminoácidos y hasta iones inorgánicos.

11 Aplicaciones Bioquímica Química clínica, forense, de alimentos
Toxicología Farmacia, farmacología Enzimología, inmunología Microbiología, Botánica, citología, Biología Molecular, etc.

12 Electroforesis zonal Empleando geles de sílice o de acetato de celulosa y aplicando las proteínas en una zona estrecha en torno a los electrodos se pueden determinar diferencias de carga neta entre proteínas (carga total/masa). Este método se denomina electroforesis zonal.

13 Además de la electroforesis zonal, se desarrollaron dos otros tipos:
Isoelectoenfoque e isotacoforesis. Estos tres métodos se basan en propiedades físicas diferentes. Es posible hacer tres análisis separados sobre una misma muestra o los métodos se pueden combinar.

14 Diversificación de soportes
Los soportes o matrices sobre los que se ha realizado la electroforesis se ha diversificado durante el tiempo de desarrollo de la electroforesis. Se ha observado que diferentes matrices dan diferentes ventajas para diferentes tipos de muestras. Algunas matrices utilizadas han sido geles de polímeros, papeles o capilares.

15 Papel Fue el primer soporte usado en las técnicas de electroforesis desarrolladas para separar compuestos (Tiselius, 1937). Es fácil de usar porque no se requiere preparación de la matriz. Es limitada su capacidad resolutiva. En 1957, Kohn usó acetato de celulosa como medio de soporte. Kohn, J., A cellulose acetate supporting medium for zone electrophoresis, Clin. Chim. Acta, 2, 297, 1957.

16 Almidón Smithies usó un gel de almidón como medio para electroforesis en 1955. Smithies, O., Zone electrophoresis in starch gels: group variations in the serum proteins of normal human adults, Biochem. J., 61, 629, 1955.

17 Capilares Jorgenson y Lukacs utilizaron capilares como matrices para la electroforesis a principios de los 1980's. Jorgenson, J. W. and Lukacs, K. D. Anal. Chem., 53, 1928, 1981. Jorgenson, J. W. and Lukacs, K. D., Science, 222, 266, 1983.

18 Poliacrilamida En 1959 Ornstein/Davis y Raymond y Weintraub utilizaron geles de poliacrilamida. Ornstein, L. and Davis, B. J., Disc Electrophoresis, Distillation Products Industries (Division of Eastman Kodak Co.), 1959. Raymond, S. and Weintraub, L., Acrylamide gel as a supporting medium for zone electrophoresis, Science, 130, 711, 1959.

19 Velocidad de migración
Es proporcional a la relación entre las cargas de la proteína y su masa. Cuanto mayor carga por unidad de masa más rápida será la migración.

20 Velocidad y movilidad de las moléculas en una electroforesis
= EQ F Movilidad = m V Q E F V, velocidad E, campo eléctrico Q, carga neta F, coeficiente de fricción

21 Poliacrilamida Los geles de poliacrilamida se forman por la polimerización de la acrilamida por acción de un agente formador de enlaces cruzados (“cross-linking”), la bis-acrilamida.

22 Reacción de polimerización
La reacción se desencadena por la presencia de un iniciador y se continua con ayuda de un catalizador. El iniciador es el ion persulfato (S2O8-) que se añade en forma de persulfato amónico (APS). Como catalizador se suele utilizar TEMED (N,N,N,N'-tetrametilendiamina). En algunas situaciones, como por ejemplo en el isoelectroenfoque en el que la presencia de persulfato puede interferir con la electroforesis se emplean otros sistemas catalizador-iniciador.

23 Oxígeno y polimerización
El oxígeno es un inhibidor de la polimerización de la acrilamida, por lo que Las soluciones de acrilamida se desgasifican para que la polimerización sea completa y a con buena velocidad. Además, durante la polimerización se libera calor (reacción exotérmica), lo que podría provocar la formación de burbujas en el seno del gel.

24 La velocidad de polimerización es proporcional a la concentración de persulfato (iniciador) y TEMED (catalizador) adicionados.

25 La porosidad del gel la determina las proporciones relativas de poliacrilamida y bis-acrilamida
Es menor el poro cuanta más bisacrilamida vs. acrilamida se use. El porcentaje total de acrilamida/bisacrilamida determina el rango de separación del gel. Los geles se denominan en función del % de acrilamida/bisacrilamida que contienen. La mayoría de las proteínas se separan bien en el rango 5 a 15%. Un menor porcentaje (mayor tamaño de poro) es mejor para separar proteínas de gran tamaño.

26 Radicales libres en la polimerización de la acrilamida
S2O8 = SO4 . Persulfato Sulfato radical libre CH2 CH C NH2 O = CH2 CH NH2 C . O = SO4 . + Acrilamida Acrilamida radical libre

27 Enlace acrilamida - bisacrilamida
O C CH2 CH CH2 CH2 C O CH2 CH2 C O C C CH2 CH2 C CH2 O CH2 CH2

28 Estructura de la poliacrilamida

29 Ventajas de los geles de poliacrilamida
Químicamente inertes, Transparentes Estables en un amplio rango de pH, temperatura y fuerza iónica.

30 CH2 N (CH2)n CH2 (CH2)n CH2 (CH2)n CH2

31 Relaciones %T y %C %T = a + b m X 100% %C = a + b X 100%
a = acrilamida (g) b = N,N’-metilenbisacrilamida m = volumen final (ml)

32 C, es crítica si es menor a 10 los geles son rígidos y opacos si excede 100 en geles con 5 % de acrilamida son pastosos y se rompen. Geles elásticos y completamente transparentes se obtienen con C de 30 y con acrilamida superior al 3%

33 No hay gelificación si la acrilamida es menor al 2% y la Bis menor a 0
Para que los geles sean elásticos la concentración de bisacrilamida debe disminuir. Puede usarse la fórmula : C = T en un rango de 5-20% de acrilamida

34 Las proteínas presentan una carga eléctrica neta si se encuentran en un medio que tenga un pH diferente al de su punto isoeléctrico y por eso tienen la propiedad de desplazarse cuando encuentran en un campo eléctrico.

35 Electroforesis nativa
Las proteínas se someten a una migración sin desnaturalización. Las proteínas migran en función de su carga, de su tamaño y de su forma. Se mantienen, en ciertos casos, las interacciones entre subunidades y entre proteínas. Los sistemas amortiguadores (tampón) usados son : tris-glicina (rango de pH 8.3 a 9.5), tris-borato (rango de pH 7.0 a 8.5) y tris-acetato (rango de pH 7.2 a 8.5).

36 Electroforesis desnaturalizante
Somete a las proteínas a migración asegurando su desnaturalización completa (pérdida de la estructura tridimensional). La migración es proporcional a la carga y al tamaño de la molécula pero no a su forma. El agente desnaturalizante más empleado es el detergente dodecilsulfato de sodio o SDS.

37 Sistemas de amortiguadores
Se puede realizar empleando sistemas de uno o más amortiguadores de pH, se habla entonces de sistemas amortiguadores continuos o discontinuos. En los sistemas discontinuos el amortiguador del primer gel asegura la migración de todas las proteínas en el frente de migración, provocando la acumulación de todas las que se han cargado en el pozo. La separación realmente comienza a partir del momento en el que el frente de migración alcanza la frontera del segundo tampón.

38 PAGE La electroforesis de proteínas en geles en una matriz de poliacrilamida es denominada electroforesis en poliacrilamida o PAGE, (“PolyAcrilamide Gel Electrophoresis”). Es una de las técnicas más ampliamente usada para caracterizar mezclas complejas de proteínas. Es un método conveniente, rápido y económico a nivel de muestra, pues se requieren sólo cantidades del orden de microgramos de proteína.

39 PAGE -SDS Su nombre significa Electroforesis en geles de poliacrilamida que se realiza en presencia de SDS (“SDS-polyacrilamide gel electrophoresis”). PAGE-SDS es la electroforesis de proteínas más ampliamente usada. Descrita por Laemmli (1970, Nature, 277:680)

40 PAGE -SDS Electroforesis desnaturalizante
Las muestras se desnaturalizan por calor en presencia de agentes desnaturalizantes: beta-mercaptoetanol, destruye los puentes disulfuro, SDS, desnaturaliza y recubre a la proteína y se separan como cadenas polipeptídicas aisladas.

41 PAGE -SDS Se emplea un sistema de dos tampones (discontinuo).
Permite la separación de volúmenes relativamente grandes de muestra sin pérdida de resolución. La concentración se produce por isotacoforesis de la muestra en el primer gel ('stacking').

42 PAGE -SDS El efecto de estrechamiento de las bandas se basa en que:
los iones glicinato, cargados negativamente de manera incompleta (en el amortiguador superior) tienen una movilidad electroforética inferior que los complejos de proteínas-SDS, Estos complejos, a la vez, tienen menor movilidad que los iones Cl- del amotiguador de muestra en el gel de compactación (“stacking”).

43 PAGE -SDS Cuando se someten las proteínas a el campo eléctrico todas las especies deben migrar a la misma velocidad para mantener el circuito eléctrico. Los iones glicinato sólo se pueden desplazar a la misma velocidad que los iones Cl- si hay una región de con un gradiente de alto voltaje. El gradiente es inversamente proporcional a la conductividad que es a su vez proporcional a la concentración.

44 PAGE -SDS El resultado es que las tres especies de interés ajustan sus concentraciones de forma que [Cl-] > [proteína-SDS] > [glicinato-]. Como sólo hay una pequeña concentración de proteína-SDS este complejo se concentra en una banda muy delgada entre las fronteras de migración del Cl- y del glicinato-. Cuando el glicinato- alcanza el borde del gel de separación adquiere una carga mayor en el nuevo medio, debido al pH superior, e incrementa su movilidad. A partir de ese momento la interfase entre el glicinato- y el Cl- deja atrás a los complejos de proteína-SDS que se desplazarán a su propia velocidad.

45 SDS Otros nombres, Dodecilsulfato de sodio, lauril-sulfato de sodio.
Detergente aniónico Desnaturalizante Se une a las cadenas polipeptídicas con una relación de 1.4 g de SDS por g de proteína, aproximadamente una molécula de SDS por cada dos aminoácidos de la cadena.

46 SDS La unión masiva de moléculas de SDS bloquea la carga propia de la molécula de proteína Le confiere al complejo una carga neta negativa proporcional a su masa. Todas las proteínas acomplejadas con SDS viajan hacia el ánodo.

47 SDS La separación de los complejos SDS-proteína es
proporcional sólo a la masa de la proteína pues todas tienen la misma carga por unidad de masa. Se puede determinar el peso molecular aparente de cualquier proteína por comparación con un patrón de proteínas de pesos moleculares conocidos. Las movilidades de las proteínas en los geles de SDS-PAGE son funciones lineales del logaritmo de su peso molecular.

48 Inicio de la PAGE discontinua
Reserva de amortiguador Tris-glicina, pH 8.3 Muestra Tris-HCl, pH 6.8 Al inicio de la electroforesis, las muestras se colocan en un pozo. El volumen puede ser variable en cada muestra aunque la cantidad de proteína debe ser constante. - Gel de compactación Tris-HCl, pH 6.8 Gel de resolución Tris-HCl, pH 8.8 + Reserva de amortiguador Tris-glicina, pH 8.3

49 Compactación (“stacking”)
Las proteínas se focalizan (compactan) formando una banda delgada El primer gel o gel de compactación (“stacking”) es de mayor poro (menor porcentaje de acrilamida+bisacrilamida) y tiene un pH más ácido que el segundo gel.

50 Separación en el gel resolutivo.
El segundo gel, o gel de resolución, es el que realmente separa a las proteínas. Presenta un poro menor y un pH de 8.8. Proteínas fraccionadas en el gel de separación Frontera Glicina/cloruro

51 Movilidad electroforética (cm) Movilidad relativa
Relación entre la movilidad electroforética y la masa molecular (PAGE-SDS) kDa 200 100 50 Logaritmo de la Masa molecular 40 30 20 2 4 6 8 10 12 0.16 0.33 0.5 0.66 0.8 1 Movilidad electroforética (cm) Movilidad relativa

52 Geles en gradiente El uso de geles de poliacrilamida que tienen un gradiente creciente de concentración de acrilamida+bisacrilamida, y en consecuencia un gradiente decreciente en el tamaño de poro, pueden tener ventajas sobre los geles de concentraciones uniformes de acrilamida.

53 Características de los geles en gradiente.
Generalmente los gradientes se establecen entre el 3 y el 30% de acrilamida en gradientes lineales o cóncavos. El rango a emplear dependerá del tamaño de las proteínas a separar. En un gel en gradiente la proteína migra hasta que alcanza una zona donde el tamaño de poro impide cualquier avance. Una vez se alcanza el “límite de poro” no se produce una migración apreciable aunque no se detiene completamente.

54 Ventajas Resuelve mejor las bandas pues las concentra en regiones muy estrechas. Incrementa el rango de pesos moleculares que se pueden resolver en un mismo gel comparado con los de una concentración fija.

55 Preparación de gradientes
Los geles en gradiente se preparan mezclando las soluciones de acrilamida de las concentraciones extremas en un formador de gradientes. Se suele adoptar la inclusión en la solución de polimerización de glicerol o sacarosa para aumentar la densidad de las soluciones y evitar las mezclas en el proceso de preparación del gradiente.

56 Formadores de gradientes
Cóncavos Lineales

57 Estructura de la Agarosa

58 Tipos de EF Electroforesis el geles en gradiente
Electroforesis Anódica (proteínas acidicas o neutras) Electroforesis catódica (proteínas básica) PAGE-SDS Websert y Osborn (fosfato) (O’Farrel) Anderson y Anderson

59 Isolectroenfoque Denominada electroenfoque o isofocalización
Se basa en el desplazamiento de las moléculas en un gradiente de pH. Las moléculas anfotéricas, como los aminoácidos, se separan en un medio en el que existe una diferencia de potencial y un gradiente de pH hasta que encuentran su pH isoeléctrico. La región del ánodo (+) es ácida y la del cátodo (-) es alcalina. Entre ambos se establece un gradiente de pH tal que las moléculas que se han de separar tengan su punto isoléctrico dentro del rango.

60 Movilidad en un gradiente de pH
Las sustancias que se encuentran inicialmente en regiones de pH inferior a su punto isoeléctrico estarán cargadas positivamente y migrarán hacia el cátodo, Las que se encuentren en medios con pH más bajos que su pI tendrán carga negativa y migrarán hacia el ánodo. Al alcanzar la región donde el pH coincidirá con su pI, tendrán una carga neta nula (forma un zwiterion) y se detendrán. De esta forma las moléculas anfotéricas se sitúan en estrechas bandas donde coincide su pI con el pH (se focalizan).

61 En esta técnica el punto de aplicación suele no ser crítico pues las moléculas siempre se desplazarán hacia la región de su pI (aunque existen excepciones). La capacidad de resolución es de 0.01 unidades de pH. El gradiente de pH estable entre los electrodos se consigue usando una mezcla de anfolitos (anfolinas) de bajo peso molecular cuyos pI cubren un rango preestablecido de pH. Los anfolitos suelen ser ácidos poliamino policarboxílicos alifáticos sintéticos y son comercializados en mezclas que cubren determinados rangos de pH.

62 Detecciones específicas
Carbohidratos Transferencia electroforética Tinción de Plata

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