Principio de preparación de una PCR

Presentación del tema: "Principio de preparación de una PCR"— Transcripción de la presentación:

1 Entrenamiento de la Practica: Prueba de modificación genética de alimentos mediante PCR

2 Principio de preparación de una PCR
Completing 60``, 94 ° Denaturation 40 cycles 120``, 94°C Denaturation 60``, 55°C Annealing 120``, 72 °C Elongation

3 I. Extracción de ADN

4 1. Preparación 1.1 Etiqueta la parte superior de 2 tubos con tapa de rosca con: - No-GMO (- GMO) - muestra de comida (T) y el número de tu grupo. Pipetea 500 µl de homo- geneizado InstaGene- Matrix dentro de cada tubo Alli debe haber la misma cantidad de gotas en los dos tubos sobrenadante gotas

5 2. Extracción de ADN de alimento no modificado genéticamente (no-GMO)
2.1 Pesa 1 g de alimento no-OGM y ponlo dentro del mortero 2.2 Añade 5 ml de H2O destilada!

6 2. 2. Extracción de ADN de alimento no modificado genéticamente (non-GMO)
2.3 Homogeniza la mezcla durante unos cinco minutos 2.4 Añade 5 ml de H2Odest. y machaca hasta que esté lo suficientemente fluido como para pipetear la mezcla

7 2.5   Pipetea 25 µl del alimento mezclado dentro del líquido del tubo con tapón enroscado etiquetado como “-GMO”! 2.6 Cierra el el tubo y agítalo bien golpeandolo ligeramente con los dedos! Para evitar la contaminación con material„+GMO DNA“ „-GMO material“ debería ser extraido primero El mortero y su mano deberían ser limpiados con un detergente y enjuagados con H2O destilada!

8 3. Extracción de ADN de una muestra de alimento
Por favor, usa guantes!!! 3.1 Pesa 1 g de muestra de comida para ser testada (T) y ponla en el mortero ! 3.2 Añade 5 ml de H2Odest.!

9 3. Extracción de ADN de una muestra de alimeto
3.3 Homogeniza la mezcla durante unos cinco minutos! 3.4 Añade de nuevo 5 ml de H2Odest. y machaca hasta que esté lo suficientemente fluido como para pipetear la mezcla

10 3.5 Pipetea 25 µl de la mezcla de alimento dentro del líquido del tubo con tapón de rosca etiquetado como “T”! 3.6 Cierra el tubo y agítalo bien mediante suaves golpes con los dedos en el tubo!

11 4. Desnaturalización de enzimas a 95°C
4.1 Coloca los dos tubos con tapón de rosca en un baño con agua a 95oC durante 5 minutos! 4.2 Centrifuga los tubos durante 5 minutos a 13000 rpm! 4.3 Pon 50 µl de sobrenadante dentro de nuevos tubos que han sido etiquetados antes!

12 Atención: Coge solo el sobrenadante sin las gotas de InstaGene, retirándolo del ADN de alimento control y del test de ADN del alimento.

13 II. Preparación: PCR y electroforesis en grupo de trabajo
Según la tarea asignada a cada grupo, este prepara una parte de la PCR y de la electroforesis para los demás grupos .

14 III. Preparación y desarrollo de la PCR

15 1. Preparación de los tubos de PCR
1.1 Numera tus tubos de PCR del 1-6! 1.2 Pipetea las preparaciones de PCR según la siguiente tabla! 1.3 Mezcla tus preparaciones de PCR pipeteando hacia arriba y abajo! 1.4 Enfría tus preparaciones de PCR en hielo hasta empezar la PCR!

16 Nr Mezcla maestra ADN 1 10 µl PMM 10 µl -GMO food control DNA 2 10 µl GMM 3 10 µl Test food DNA (T) 4 5 10 µl +GMO control DNA 6

17 2. Desarrollo de PCR Desarrolla la PCR según el programa de temperatura del termociclador! Presta atención a la posición de tus muestras en el termociclador para evitar confusiones! Asegurate de que tus tubos están adecuadamente cerrados! Overview of the tubes in the cycler Cycler- Program

18 IV. Evidencia de productos PCR por electroforesis (Agarosa/PAGE)
Según tu tarea asignada haz evidentes los productos PCR, por medio del desarrollo de electrophoresis en gel de Agarosa o en gel de Poliacrilamida Según tu tarea tiñe tus geles y analízalos! Filling the gelslots