BIOLOGIA MOLECULAR APLICADA AL LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA

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1 BIOLOGIA MOLECULAR APLICADA AL LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA
Dra Daniela Centrón Depto de Microbiología, Parasitología e Inmunología de la Facultad de Medicina de la Universidad de Buenos Aires CONICET

2 Que es la biología molecular?
Estudio de la biología a nivel molecular Se superpone con áreas de la biología y la química, en particular genética y bioquímica Estudio de los procesos celulares

3 De la genética clásica a la biología molecular
al diagnóstico especializado……

4 CONTENIDOS I. CONCEPTOS BASICOS INTRODUCTORIOS
A. Biosíntesis de ácidos nucleicos: replicación, transcripción. B. Biosíntesis de proteínas: traducción. C. Marcos de lectura abiertos. Operones y regulones. II. TECNOLOGIA DEL ADN RECOMBINANTE A. Enzimas utilizadas en biología molecular. B. Vectores de clonado y de expresión. C. Construcción de bibliotecas genómicas. III. CONCEPTOS BASICOS DE GENETICA MICROBIANA A. Mutaciones y mutantes. B. Elementos extracromosómicos. Plásmidos. C. Adquisición de material genético exógeno.

5 IV. METODOLOGIAS BASADAS EN LA IDENTIFICACION
DE SECUENCIAS DE A. NUCLEICOS A. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR). B. Hibridización de ácidos nucleicos. C. Epidemiología molecular bacteriana. D. ADN ramificado (branched DNA). E. Secuenciación de ácidos nucleicos. V. DIAGNOSTICO MOLECULAR DE AGENTES ETIOLOGICOS MICROBIANOS A. Bacterias B. Virus C. Hongos D. Mecanismos de resistencia a antibióticos VI. SEMINARIOS DE INTEGRACION

6 CRONOLOGÍA Genética AM y DM Mendel 1866

7 GENÉTICA AM Las partículas de la herencia se mezclaban
Un parental aporta más que el otro Herencia de caracteres adquiridos

8 MENDEL Y LOS “FACTORES” DE LA HERENCIA

9 GENÉTICA DM LA GENÉTICA Y LOS GENES......

10 Que características debería presentar el material hereditario?
ADN o PROTEÍNAS? ….en busca del material hereditario…. Que características debería presentar el material hereditario? Perpetuarse (replicarse) Manifestarse (expresarse) Cambiar (mutar) Combinarse (recombinarse)

11 1902-Theodore Boveri- William Sutton
1865 Establecen la hipótesis según la cual los cromosomas, segregados de modo mendeliano, son unidades hereditarias.

12 1915 - T.H. Morgan Los genes se disponían linealmente en el cromosoma
1865 Los genes se disponían linealmente en el cromosoma Se comienza a hablar de genética.....

13 1928 - Frederick Griffith Transformación de Streptococcus pneumoniae
1865 Colonias “Rugosas” Colonias “Lisas” Transformación de Streptococcus pneumoniae Células L muertas por calor Células L muertas por calor junto a celular R vivas Células L vivas Células R vivas cápsula Bacteria “factor de transformación” Inyección Resultados

14 El ADN de las células lisas transformaba a las rugosas
Avery, MacLeod & McCarty 1865 El ADN purificado es “el factor de transformación” El ADN de las células lisas transformaba a las rugosas Oswald Avery Colin MacLeod Maclyn McCarty

15 Su teoría fue rechazada por dos razones:
De ser así cada especie debería tener un tipo diferente de ADN La composición química del ADN era demasiado simple para contener toda la información para la vida

16 Hershey & Chase 1865 El ADN viral (no las proteínas) programa las células Martha Chase & Alfred Hershey Bacteriófagos … “los genes se componen de ADN, base química de la herencia”…

17 LA ESTRUCTURA DEL ADN...

18 Las bases de ADN siguen ciertas reglas
Erwin Chargoff 1865 Las bases de ADN siguen ciertas reglas La composición es especie específica A = T, C = G en todas las especies AT GC

19 1953 - Franklin & Wilkins La naturaleza helicoidal del ADN
1865 La naturaleza helicoidal del ADN Rosalind Franklin Film fotográfico Fuente de rayos X DNA cristalizado Maurice Wilkins

20 Francis Crick & James Watson
Watson & Crick 1865 Descripción de la estructura tridimensional del ADN Francis Crick & James Watson

21 1953 - Watson & Crick Que dedujeron de: Datos de R. Franklin
1865 Que dedujeron de: Datos de R. Franklin hélice doble ancho uniforme de 2 nm bases separadas por 0.34 nm Chargoff la adenina se aparea con la timina la citocina se aparea con la guanina

22 1953 - Watson & Crick Que dedujeron ellos mismos?
1865 Que dedujeron ellos mismos? Las bases están hacia adentro, y los fosfatos y las azúcares hacia afuera Enlaces de hidrógeno Hebras antiparalelas Sugirieron un modo semi-conservativo de replicación

23 ESTRUCTURA DEL ADN J. D. WATSON and F. H. C. CRICK
... 2 de abril de 1953, Molecular Structure of Nucleic Acids. A Structure for Deoxyribose Nucleic Acid. Nature 171: 737. No más de 900 palabras….. J. D. WATSON and F. H. C. CRICK

24 QUE ES EL ADN??? Bases nitrogenadas POLÍMERO LARGO, NO RAMIFICADO,
COMPUESTO POR CUATRO TIPOS DE SUBUNIDADES Bases nitrogenadas Se combinan con azúcares y fosfatos

25 Nucleótido=base+azúcar+fosfato Nucleósido=base+azúcar
DESOXIRIBONUCLEÓTIDOS Nucleótido=base+azúcar+fosfato Nucleósido=base+azúcar MONÓMERO

26 Del nucleótido al ADN 5´ DIRECCIÓN (5´a 3´) 5´
ENLACE FOSFODIESTER ENTRE EL CARBONO 5´ DE UNA DESOXIRRIBOSA CON EL GRUPO FOSFATO DEL SIGUIENTE NUCLEÓTIDO FORMANDO UN NUCLEÓTIDO MONOFOSFATO. EL POLÍMERO SE FORMA AL ENLAZAR LOS FOSFATOS AL 3´ DEL OTRO NUCLEÓTIDO 5´ DIRECCIÓN (5´a 3´) 5´

27 Estructura estabilizada por puentes hidrógeno
Doble hebra Antiparalela 5´ 3´ 5´ 3´ ESTRUCTURA PRIMARIA

28 Apareamiento: A-T G-C Polímero uniforme Surco menor Surco mayor
10 bases por vuelta Surco mayor ESTRUCTURA SECUNDARIA

29 REGION REGULATORIA Codón de iniciación Codón de terminación

30 ADN en Procariotas ESTRUCTURA TERCIARIA Cromosoma bacteriano
1865 ESTRUCTURA TERCIARIA Cromosoma bacteriano ADN doble cadena (1mm long) circular cerrado Condensado y ordenado (“supercoiled” o superenrollado)

31 Plásmidos en Procariotas
1865 Tamaño de 1 a 400Kb Cantidad variable de copias en una célula Origen de replicación propio Pueden movilizarse a otros genomas Puede integrarse al cromosoma bacteriano

32 ADN en Eucariotas Moléculas de ADN en mitocondrias y cloroplastos
1865 1 o más cromosomas de ADN (hasta 1200 en helechos) Localizado en núcleo Empaquetado por histonas y otras proteínas cromatina Moléculas de ADN en mitocondrias y cloroplastos

33 dos hebras generan una copia cada una
Replicación del ADN 1865 Semiconservativa: dos hebras generan una copia cada una

34 Iniciación comienza siempre en una secuencia específica de nucleótidos
1865 comienza siempre en una secuencia específica de nucleótidos conocida como origen de replicación, en el que hay un gran contenido de adenina y timina.

35 Origen de replicación (oriC)
Iniciación 1865 iniciador Iniciación de la replicación Horquillas se mueven en dirección opuesta ADN lineales (Eucariotas) Varios replicones Síntesis de primers de ARN Unión de iniciador Formación de dos hebras de replicación ADN circulares (Procariotas) Origen de replicación (oriC)

36 Elongación ADN primasa ARN primer ADN polimerasa III ADN ligasa
1865 ADN primasa ARN primer ADN polimerasa III ADN ligasa Hebra retrasada Frag. de Okazaki Hebra líder Topoisomerasa ADN polimerasa III Helicasa Proteínas de unión al ADNss La ADN polimerasa sintetiza las nuevas cadenas, complementarias a cada una de las cadenas primitivas, en sentido 5´ → 3´ partiendo de un ARN corto específico llamado ARN cebador –molécula formada por nucleótidos de ARN catalizados por ARN primasas- que determina el punto por donde la ADN polimerasa comienza a añadir nucleótidos.

37 Pol III escinde G con actividad exonucleasa 3´ a 5´
“Proof-reading” DNA polimerasa comete un error cada 108 – 1010 bases Incorporación de A Incorporación de G X A Pol III escinde G con actividad exonucleasa 3´ a 5´

38 se completa la doble hélice de ADN.
Terminación 1865 Fragmentos de Okazaki Ligasa Cuando una ADN polimerasa hace contacto con el extremo de otro fragmento de Okazaki contiguo, el ARN cebador de este es eliminado y otra enzima, la ADN ligasa, conecta los dos fragmentos de Okazaki de ADN recién sintetizado, catalizando las reacciones de condensación que unen los grupos fosfato y azúcar de los nucleótidos contiguos y así, una vez unidos todos los fragmentos de Okazaki se completa la doble hélice de ADN.

39 Transferencia de información
Francis Crick 1865 Propuso el dogma central ADN ARN PROTEINAS Transferencia de información biológica

40 El ADN y el ARN Ácidos nucleicos Macromoléculas
1865 Ácidos nucleicos Macromoléculas Polímeros (monómero de nucleótidos) Uniones fosfodiéster Moléculas más grandes que se conocen.

41 Diferencias entre la química del ADN y el ARN
1865 El ARN tiene como carbohidrato a la ribosa en lugar de la desoxirribosa. El ARN tiene como base el uracilo en lugar de la timina. Una célula típica contiene 10 veces más ARN que ADN. El ARN no es una doble cadena excepto en algunos virus.

42 Estructura del ARN 1865

43 ARNr (ribosomal) Tipos de ARN según sus funciones
1865 Componente principal del ribosoma ARNr (ribosomal) Decodifica el ARNm para sintetizar las proteínas Interacciona con ARNt durante la traducción En Procariotas, dos subunidades principales 30Sy 50S En Eucariotas, 40S y 60

44 ARNt (de transferencia) Tipos de ARN según sus funciones aa anticodón
1865 ARNt (de transferencia) aa Encargados de transportar los aminoácidos a los ribosomas para incorporarlos a las proteínas, durante el proceso de síntesis proteica. Decodificación mediante apareamiento con el codón del ARNm anticodón

45 Tipos de ARN según sus funciones
1865 ARNnc o ARN no codificante: ARN funcional que no codifica para síntesis proteica (ARNr y ARNt) ARN corto de interferencia (siARN: del inglés: small interfering RNA ): son componentes de una gran respuesta antiviral denominada interferencia del ARN involucrados en la regulación. Ribo-llaves (ribo-switches): son formas de ARN que actúan como llaves "encendido-apagado" de gran precisión. ARN catalíticos o ribozimas: ARN con estructura secundaria que le confiere a la molécula propiedades catalíticas como corte de ARN o ADN y ligación. El ARN posiblemente fue el primer biopolímero que apareció en la corteza terrestre durante el transcurso de la evolución.

46 Como se leen los ARNm??

47 1961- Nirenberg y Ochoa UUUUUUUU fenilalanina AAAAAAAA lisina
1865 Sistema libre de células UUUUUUUU fenilalanina AAAAAAAA lisina CCCCCCCC prolina GGGGGGG glicina

48 El código genético 43=64

49 ARNm

50 Demostraron que hay 61 tripletes -o codones-
que codifican aminoácidos, muchos de los cuales son codificados por más de un codón, por lo que se dice que el código está degenerado. y los tres restantes no son codificantes sino que son utilizados como señales de terminación.

51 TRANSCRIPCIÓN ADN ARN PROTEINAS Requerimientos: Cadena de ADN
1865 ADN ARN PROTEINAS Requerimientos: Cadena de ADN como matriz ARN polimerasa Ribonucleósidos trifosfatos Región promotora

52 va a iniciar la transcripción
TRANSCRIPCION ARN polimerasa Principio de un gen ADN Iniciación La ARN polimerasa junto a factores de transcripción se une a sitio donde va a iniciar la transcripción

53 Promotor En bacterias Dos regiones conservadas en el ADN (-10 y -35) que son reconocidas por factor sigma. ARN polimerasa luego se une y sintetiza ARN de 5´ a 3´ Un promotor expresa varios genes (OPERÓN)

54 Promotor en Eucariotas
Región promotora Involucra varios factores de transcripción (proteínas) Cada gen tiene su promotor

55 TRANSCRIPCION Elongación Hebra antisentido
Dirección de la transcripción 3´del gen 5´del gen 5´del ARNm 3´ del ARNm Hebra sentido: contiene la información genética Hebra antisentido: provee el molde para la síntesis del ARNm ARNm Elongación Una cadena de ARN se une por apareamiento de bases a la cadena de ADN y la ARN polimerasa es la encargada del enlace fosfodiéster.

56 TRANSCRIPCIÓN Terminación Desestabilización del complejo ARN-ADN
La ARN polimerasa deja el ADN ARN mensajero liberado El ADN se aparea nuevamente Terminación Desestabilización del complejo ARN-ADN Rho-independiente (Secuencias palindrómicas del ADN que en estadio de ARN adopta una estructura en horquilla) Rho-dependiente (mediada por la proteína)

57 TRANSDUCCIÓN ADN ARN PROTEÍNAS El nombre proteína proviene
1865 El nombre proteína proviene de la palabra griega proteios, que significa lo primero. ADN ARN PROTEÍNAS Las proteínas son macromoléculas formadas por aminoácidos

58 Uniones hidrógeno entre
TRADUCCION ARNt Sitio de unión al aminoácido Uniones hidrógeno entre pares de bases Iniciación La iniciación procariótica es el resultado de la asociación de las subunidades pequeña y grande del ribosoma y el acoplamiento del primer aminoacil-ARNt (fmet-ARNt) con el codón de iniciación mediante el emparejamiento de bases anticodón-codón.

59 La elongación de la cadena polipeptídica
TRADUCCION Elongación La elongación de la cadena polipeptídica consiste en la adición de aminoácidos al extremo carboxilo de la cadena.

60 TRADUCCION Continua la elongación Este proceso continua hasta
que llega a un codón stop Polipéptido Creciente

61 del ARNm, que no son reconocidos por ningún ARNt.
TRADUCCION Nueva proteína sintetizada Carboxilo terminal Amino terminal Terminación La terminación ocurre cuando se llega a uno de los tres codones de terminación del ARNm, que no son reconocidos por ningún ARNt.

62

63 Human Gene Nomenclature Committee
QUÉ ES UN GEN ? Un segmento de ADN que contribuye a un fenotipo/función. En ausencia de una función demostrable, un gen puede ser caracterizado por secuencia, transcripción u homología. Human Gene Nomenclature Committee

64 Transcripción policistrónica (ARNm de varios genes)
En Procariotas..... Operón Transcripción policistrónica (ARNm de varios genes)

65 Un promotor para cada gen
En Eucariontes... REGION REGULATORIA EXONES FIN TRANSCRIPCION +1 INTRONES Un promotor para cada gen

66 LA DECADA DE LOS 70 LA ERA RECOMBINANTE

67 ENZIMAS DE RESTRICCIÓN
MÉTODOS DE SECUENCIACIÓN MÓLECULAS RECOMBINANTES

68 Descubrimiento de las enzimas de restricción
Smith & Nathans 1865 Descubrimiento de las enzimas de restricción Hamilton Smith Descubrió HindII en Haemophilus influenzae Daniel Nathans Utilizó HindII para hacer el primer mapa de restricción del SV40

69 1972 - Paul Berg El primer ADN recombinante utilizando EcoRI
1865 El primer ADN recombinante utilizando EcoRI Sitios de reconocimientoEcoRI DNA plasmidico EcoRI corta el DNA en fragmentos Extremos pegajosos SV40 DNA DNA ligasa DNA recombinante

70 Transformación de E. coli con plásmidos recombinantes
Boyer, Cohen & Chang 1865 Transformación de E. coli con plásmidos recombinantes Gen resistente a la canamicina Gen resistente a la tetraciclina Plasmid pSC101 Stanley Cohen & Annie Chan Medio con canamicina y tetraciclina E. coli transformada con plásmidos recombinantes Sólo crecen colonias recombiantes Herbert Boyer

71 Genentech, Inc. 1865 La primera proteína humana producida por una bacteria transgénica (somatostatina) Compañía fundada por Herbert Boyer y Robert Swanson en 1976 Considerada el advenimiento de la edad de la biotecnología

72 Y LA GENÉTICA DE LA CONSERVACIÓN
LA DECADA DE LOS 80 LOS TRANSGÉNICOS Y LAS BASES DE DATOS Y LA GENÉTICA DE LA CONSERVACIÓN

73 1865 1980 La suprema corte de U.S. permite patentar formas de vida 1985 Se prueban plantas modificadas genéticamente En 1988 el National Center for Biotechnology Information (NCBI) y el GenBank Margaret Dayhoff

74 LA DECADA DE LOS 90 GENOMAS Y CLONES

75 LOS 90: GENOMAS Y CLONES 1865 1995 primer genoma: Haemophilus influenzae. 1996 Genoma de Saccharomyces cerevisiae 1997 Se clona Dolly 1998 Genoma de C. elegans

76 2000 COMO FUNCIONA UN GENOMA? GENÓMICA Y PROTEÓMICA

77 26 de junio del 2000: se concluyó
el proyecto del GENOMA HUMANO, en el cual se invirtió más de millones de dólares…..

78 EL FUTURO......

79 Genómica y sociedad Genómica y salud Genómica biológica

80 MUCHAS GRACIAS!!!!!!!!!!!