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Las Lipasas : Aplicaciones en Biotecnología. Definición : Una lipasa verdadera (EC 3.1.1.3) se define como una carboxilesterasa capaz de catalizar la.

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1 Las Lipasas : Aplicaciones en Biotecnología

2 Definición : Una lipasa verdadera (EC ) se define como una carboxilesterasa capaz de catalizar la hidrólisis y la síntesis de acilgliceroles de cadena larga, teniendo como sustrato standard a la trioleina. Acilglicerolhidrolasas o triacilglicerolhidrolasas

3 Origen de las lipasas: Las lipasas son enzimas ubicuas que pueden ser encontradas en:Las lipasas son enzimas ubicuas que pueden ser encontradas en:MicroorganismosPlantasAnimales Comercialmente en su mayoría son de origen microbianoComercialmente en su mayoría son de origen microbianoHongosBacteriasLevaduras GeneralidadesGeneralidades Peso molecular kD Contienen 2-15% de carbohidratos pH óptimo = 8-9 lipasas animales; microbianas Topt = o C

4 Lipasas disponibles comercialmente

5 Origen de la lipasa % de proteína Actividad vs Trioleína U/mg Bandas SDS-PAGE kD bandas SDS-PAGE Número de bandas esterasa % de actividad proteolítica Rhizomucor miehei Rhizopus spec , Humicola lanuginosa , Candida rugosa I ,30,43, 67,90 132<1 Candida rugosa II ,67112<1 Geotrichum candidum <1 Pseudomonas fluorescens ,25,40, 43 63<1 C.viscosum I ,30,40310 C. viscosum II ,30, Pureza de lipasas disponibles comercialmente

6 Origen de la lipasa Observaciones Candida rugosa (CRL) Inicialmente clasificado como Candida cylindracea, clonación y purificación de la proteína revela al menos cinco isoformas. Geotrichum candidum (GCL) Contiene dos isoformas que se diferencían en la especificidad cis o trans en acidos grasos insaturados Rhizopus (RAL, ROL,RDL, RNL) En la literatura se reportan diferentes especificidades aunque la clonación reveló identidad casi total. Penicillium camembertii (PeCL) Clasificada como lipasa de P. cyclopium hasta 1990, recientemente se encontraron cuatro isoformas que difieren principalmente en el patrón de glicosilación Pseudomonas glumae (PGL) Clonación y secuenciación reveló alta identidad con la lipasa de Chromobacterium viscosum (CVL). Pseudomonas cepacia (PCL) Reclasificada en 1995 como Burkholderia cepacia. Clonación y secuenciación reveló identidad con la lipasa de Pseudomonas. sp. ATCC21808 (PSL). Controversias en las propiedades de lipasas disponibles comercialmente

7 Clasificación reciente basada en los motivos conservados de su secuencia y en sus propiedades biológicas

8 Propiedades estructurales : Plegamiento común de las lipasas Patrón de plegamiento / compuesto por un core de hebras rodeado por helices tipico de numerosas hidrolasas El sitio activo esta compuesto de una triada catalítica formada por Ser- His-Asp/Glu A diferencia de muchas enzimas el sitio catalítico no esta expuesto en la superficie, se encuentra cubierto por residuos hidrofóbicos Asp/Glu His Ser C N ABC D F En rojo se presentan los motivos comunes a todas las lipasas En blanco se presentan los motivos presentes en la mayoría de las lipasas Las hélices A y F están en el lado cóncavo de las hebras La hélice D esta a menudo compuesta de una sola vuelta

9 Mecanismo de activación interfacial en las lipasas

10 El sitio catalítico de muchas lipasas se encuentra cubierto por una tapa formada por un loop Este arreglo estructural hidrfóbico al interaccionar con superficies hidrofóbicas genera una estructura catalíticamente activa de tapa abierta Se localiza desde el N terminal o desde el C terminal Cutinasa (lipasa) no posee esta tapa C) estructura cerrada D)estructura abierta Mecanismo de activación interfacial en las lipasas

11 La presencia de la tapa cubriendo el sitio activo de las lipasas y el fenómeno de activación interfacial no adecuado para distinguir lipasas de esterasas. Varias enzimas tienen la tapa hidrofóbica pero no presentan activación interfacial p.e. Pseudomonas glumae, Pseudomonas aeruginosa, C.antarctica B, y lipasa pancreática, lipasa

12 Vista de arriba de la lipas de Mucor mieheiVista de arriba de la lipas de Mucor miehei En rojo zonas polares y en azul zonas hidrofóbicasEn rojo zonas polares y en azul zonas hidrofóbicas En amarillo sitio activoEn amarillo sitio activo C) estructura cerrada D)estructura abierta Acceso al sitio catalítico de las lipasas

13 Se han identificado cuatro sitios de reconocimiento del sustrato en el sitio activo : Un agujero oxianión y tres sitios de unión específica de los residuos acilo en los triglicéridos, sitios sn-1, sn-2, y sn-3 del glicerol sn3 RO OR sn1 sn2 La diferencia de tamaño y del balance hidrofóbico/hidrofílico en estos sitios determina la especificidad de cada lipasa Especificidad por el tamaño de la cadena acilada Regioespecificidad sn-1, sn-2, y sn-3 Sitio activo y especificidad en lipasas

14 Mecanismo catalítico

15 Reacciones catalizadas por las lipasas O R1R1R1R1 OR 2 + H2OH2OH2OH2O O R1R1R1R1OH + R 2 OH Hidrólisis O R1R1R1R1OH + R2OR2OR2OR2O + HOH Esterificación O ROH + + HOH EsterificaciónO R3R3R3R3OH +O R1R1R1R1 OR 2 TransesterificaciónO R1R1R1R1OH +O R3R3R3R3 O R1R1R1R R 2 OH O R1R1R1R1 OR 3 R 3 OH O R1R1R1R1 OR 2 Acidólisis Alcoholisis

16 O R3R3 OR 4 + O R1R1 OR 2 Interesterificación O R1R1 OR 4 + O R3R3 OR 2 O R1R1 + O R + R 3 NH 2 + R 2 OH Aminólisis O R1R1 NHR3 O R1R1 OH + + HOH O ROH + R 2 SH + HOH Tioesterificación O R1R1 SR 2 O R1R1 + O ROH + R 3 NH 2 + HOH Amidación O R1R1 NHR3 (cont.)

17 Control del equilibrio termodinámico del proceso Control del grado de acilación de polioles Monoésteres, Diésteres, Triésteres…….. -Emulsificantes para especialidades farmacéuticas -Vehículos para medicamentos -Bloques de construcción en síntesis orgánica

18 Actividad termodinámica: a = X = coeficiente de actividad X = fracción mol El coeficiente de actividad termodinámica función del número del número y tipo de interacciones soluto-solvente Control de la posición del equilibrio termodinámico

19 Control de la posición del equilibrio termodinámico en reacciones laterales Bloqueo de la síntesis de di- y triésteres por aumento de sus coeficientes de actividad Favorecer la síntesis de monoésteres por disminución de sus coeficientes de actividad

20 Coeficiente de actividad alto = baja interacción soluto-solvente, baja concentración al equilibrio Coeficiente de actividad bajo = alta interacción soluto-solvente, alta concentración al equilibrio

21 Buena solubilidad del ácido graso >0.5 M Compatibilidad de las enzimas con solventes hidrofóbicos Baja solubilidad del glicerol Síntesis enzimática de monooleína : Glicerol + Ácido oléico en n -hexano trioleina dioleina monooleina Rendimiento alto: 80% Baja selectividad por monoésteres Trioleina 70% Dioleina 27% -Monooleina 3%

22 Síntesis selectiva de monoésteres de polioles

23 Modelo de predicción de la síntesis selectiva de monoésteres de polioles Cálculo teórico de los coeficientes de actividad por UNIFAC Calculo de las actividades termodinámicas de los productos al equilibrio Buena correlación del modelo con resultados teóricos

24 Síntesis selectiva de monooleina por glicerólisis Se pueden alcanzar concentraciones de producto entre M Proceso que se puede realizar en reactor contínuo

25 Síntesis selectiva de ésteres de xilitol

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27 Predicción de la abundancia de los prooductos en función de la polaridad del medio de reacción Evaluado para un gran número de mezclas de solventes (acetona, acetonitrilo, DMSO, hexano, 2M2P, ……..) Coeficiente de actividad en función del parámetro de polaridad ET30

28 Amida 95% Amida 54%Ester 95% Ester 52% 2M2B n -hexane Baja actividad termodinámica de ésteres en n -hexano Baja actividad termodinámica de amidas en 2M2B Control de la quimioselectividad del proceso

29 Resolución de mezclas racémicas quimioselectivamente

30 Síntesis preferencial de amidas en 2M2B Reacción enantioselectiva Síntesis de inductores selectivos de apoptosis en células cancerosas 3-(4-Hydroxy-3-(S)-methoxy-phenyl)-N-[2-(4-hydroxy-phenyl)-2-methoxy-ethyl]- acrylamide

31 Market Share Forecast Growth of Biological Decline of Traditional The Chiral Market

32 50% : (2R,4R)25% : (2R,4S) 25% : (2S,4S) Enantioselectividad Poderosos Bloques de construcción en química orgánica Enzimas mas utilizadas: Lipasas Esterasas Amidasas

33 Resolución cinética con lipasas Evitar reversibilidad de la resolución

34 Generación de centros quirales por acilación Bloques de construcción en síntesis orgánica Construcción de librerias Resolución de centros quirales (en polioles) Modelos moleculares para RMN

35 Easy-On, Easy-Off Technology Sintesis-hidrólisis de amidas Imposible la hidrólisis de amidas con lipasas Proceso altamente enantioselectivo

36 SOLVENT SYSTEMS AND PROCESSES 1. Aqueous Reaction Media : Hidrolysis 2. Water: Water-Miscible Systems : Hydrolysis or Synthesis 3. Water: Water-Immiscible Systems : Hydrolysis or Synthesis 4. Nonaqueous Reaction Media : Synthesis 5. Anhydrous Reaction Media : Synthesis 6. Supercritical Fluids : Synthesis 7. Reverse Micellar Systems : SynthesisSistemas con bajo 8. Solvent-Free Systems : Synthesiscontenido de agua 9. Gas-Phase Catalysis : Synthesis 10. Ionic Liquids : Synthesis Sistemas de reacción para las lipasas

37 A.Immobilization Adsorption onto solid supports such as silica gelAdsorption onto solid supports such as silica gel Covalent attachment to solid supportsCovalent attachment to solid supports Entrapment in organic polymers or microemulsions.Entrapment in organic polymers or microemulsions. B. Chemical Modification 1.Cross-Linking : Use of glutaraldehyde to prepare insoluble cross-linked enzyme crystal (CLEC)Use of glutaraldehyde to prepare insoluble cross-linked enzyme crystal (CLEC) P. cepacia and C. antarctica lipases for CLEC-catalyzed resolution of phenyl acetate (ALTUS-Biotech)P. cepacia and C. antarctica lipases for CLEC-catalyzed resolution of phenyl acetate (ALTUS-Biotech) PREPARATION OF MODIFIED LIPASES

38 2. Modification with Polyethylene Glycol, Polymers and Surfactants Enhanced stability of C. rugosa lipase in isooctane by treating the enzyme with p- nitrophenyl chloroformate and cyanuric acid chloride activated PEG.Enhanced stability of C. rugosa lipase in isooctane by treating the enzyme with p- nitrophenyl chloroformate and cyanuric acid chloride activated PEG. Alternative to PEG is to use the nonionic amphiphilic polyoxyethylene lauryl ether (Brij 35) as a covalent modifierAlternative to PEG is to use the nonionic amphiphilic polyoxyethylene lauryl ether (Brij 35) as a covalent modifier Hydrophobic polymers such as polystyrene and polymethylHydrophobic polymers such as polystyrene and polymethyl methacrylate or amphiphilic polymers such as poly N-vinylpyrrolidone Nonionic synthetic dialkyl amphiphiles or sorbitan monostearate (Span 60)Nonionic synthetic dialkyl amphiphiles or sorbitan monostearate (Span 60)

39 Aplicaciones industriales de las lipasas Aplicaciones en oleoquímica : Hidrólisis de triglicéridosAplicaciones en oleoquímica : Hidrólisis de triglicéridos Disponibilidad de materia prima, 60 millones de tons de aceites y grasas por año. Disponibilidad de materia prima, 60 millones de tons de aceites y grasas por año. Cinco millones de toneladas para uso no alimentarioCinco millones de toneladas para uso no alimentario La principal aplicación es la obtención de jabones, proceso químicoLa principal aplicación es la obtención de jabones, proceso químico El uso alternativo de las lipasas (hidrólisis de grasas y aceites) permite condiciones mas suaves, mejor calidad del producto y mejor rendimiento de glicerol como subproductoEl uso alternativo de las lipasas (hidrólisis de grasas y aceites) permite condiciones mas suaves, mejor calidad del producto y mejor rendimiento de glicerol como subproducto Miyoshi Yushi, en Nagoya, Japón, la única empresa en el mundo que usa esta tecnología con Candida rugosa lipase.Miyoshi Yushi, en Nagoya, Japón, la única empresa en el mundo que usa esta tecnología con Candida rugosa lipase. Proceso en lote a 40 o C, durante 48 horasProceso en lote a 40 o C, durante 48 horas

40 An alternative source of energy for public transport is the so-called biodiesel, reduces sulfur oxide production.An alternative source of energy for public transport is the so-called biodiesel, reduces sulfur oxide production. METHYL ESTERS OF FATTY ACIDSMETHYL ESTERS OF FATTY ACIDS Produced chemically using oil from various plants (e.g. rapeseed).Produced chemically using oil from various plants (e.g. rapeseed). Alcohoysis catalyzed by KOHAlcohoysis catalyzed by KOH Can be catalysed in a single transesterification reaction using lipases in organic solvents.Can be catalysed in a single transesterification reaction using lipases in organic solvents. At an industrial scale failed so far because of the high cost of the appropriate biocatalyst.At an industrial scale failed so far because of the high cost of the appropriate biocatalyst. Two strategies were recently presented :Two strategies were recently presented : Immobilisation of P. fluorescens lipase increased its stability even upon repeated useImmobilisation of P. fluorescens lipase increased its stability even upon repeated use Cytoplasmic overexpression of Rhizopus oryzae lipase in Saccharomyces cerevisiae with subsequent freeze-thawing and air drying resulted in a whole-cell biocatalystCytoplasmic overexpression of Rhizopus oryzae lipase in Saccharomyces cerevisiae with subsequent freeze-thawing and air drying resulted in a whole-cell biocatalyst Síntesis de metil- o etil- ésteres de ácidos grasos por alcoholisis : BiodieselSíntesis de metil- o etil- ésteres de ácidos grasos por alcoholisis : Biodiesel

41 Mejoramiento de la untabilidad de los aceites Se puede modular el punto de fusión de una grasa por hidrogenación de dobles enlaces Un metodo alternativo es la incorporación de ácidos grasos saturados al aceite por interestificación enzimática sn3 RO OR sn1 sn2 sn3 XO OX sn1 sn2 + sn3 RO OX sn1 sn2 sn3 XO OR OX sn1 sn2 + Lipase

42 Síntesis de sustitutos de grasa de cacao En ,000 toneladas de grasa de cacao fueron exportadas por Kenia y MalasiaEn ,000 toneladas de grasa de cacao fueron exportadas por Kenia y Malasia Grasa con demanda en alimentos y farmacia (Pf = 37 o C)Grasa con demanda en alimentos y farmacia (Pf = 37 o C) sn3 XO OR OY sn1 sn2 Para X = oléico, Y = esteárico y R = palmítico Grasa de cacao compuesta de SOS o SOP primordialmente Interesterificación enzimática del aceite de palma (POP) o de girasol (OOO) con ácido esteárico o triesterarina (SSS).Interesterificación enzimática del aceite de palma (POP) o de girasol (OOO) con ácido esteárico o triesterarina (SSS). Uso de lipasas 1,3 específicas en proceso limpioUso de lipasas 1,3 específicas en proceso limpio Unichema (ICI) produce varios cientos de toneladas y Fuji Oil varios miles de toneladas utilizando lipasas de Rhizopus.Unichema (ICI) produce varios cientos de toneladas y Fuji Oil varios miles de toneladas utilizando lipasas de Rhizopus.

43 Grasas de alta digestibilidad Mejoramiento en la absorción de triglicéridosMejoramiento en la absorción de triglicéridos Triglicéridos con palmítico en posición sn-2 mejor absorciónTriglicéridos con palmítico en posición sn-2 mejor absorción sn3 XO OR OY sn1 sn2 Para X = palmítico Grasas de alta digestibilidad, p.e. leche materna Unichema produce OPO en dietas para niños prematuros por interestirificación de tripalmitina y ácido oléicoUnichema produce OPO en dietas para niños prematuros por interestirificación de tripalmitina y ácido oléico Otro tipo de grasas de facil digestión son MLM (M=medium, L=long refiriendose al tamaño de cadena acilada)Otro tipo de grasas de facil digestión son MLM (M=medium, L=long refiriendose al tamaño de cadena acilada) Caprenin (C6,C22:0,C8) producido por Procter&Gamble mediante síntesis químicaCaprenin (C6,C22:0,C8) producido por Procter&Gamble mediante síntesis química

44 Síntesis de emulsificantes Monoglicéridos emulsificantes mas utilizados en la industria de alimentosMonoglicéridos emulsificantes mas utilizados en la industria de alimentos 150,000 ton preparadas por glicerólisis química a partir de triglicéridos150,000 ton preparadas por glicerólisis química a partir de triglicéridos Los métodos enzimáticos incluyen :Los métodos enzimáticos incluyen : Esterificación y glicerólisis Bajos rendimientos y proceso económicamente desfavorableBajos rendimientos y proceso económicamente desfavorable Necesidad de abaratar el costo del biocatalizador y aumentar su estabilidad operacionalNecesidad de abaratar el costo del biocatalizador y aumentar su estabilidad operacional

45 Aplicaciones diversas (Hidrólisis) Detergentes: Remoción de productos lipídicosDetergentes: Remoción de productos lipídicos Productos comerciales : Lipolasa de Novo-Nordisk, Lipomax de Gist-Brocades y Lumafast de Genencor.Productos comerciales : Lipolasa de Novo-Nordisk, Lipomax de Gist-Brocades y Lumafast de Genencor. Industria papelera : Eliminación de triglicéridos de pulpa de celulosa o eliminación de tintas a base de lípidos en papel reciclado por Nihon Seishi Co.,Industria papelera : Eliminación de triglicéridos de pulpa de celulosa o eliminación de tintas a base de lípidos en papel reciclado por Nihon Seishi Co., Industria de lacteos : mejorar la calidad de cuajadas, generación de aromas y sabores en quesos o preparación de aditivos a partir de productos lacteosIndustria de lacteos : mejorar la calidad de cuajadas, generación de aromas y sabores en quesos o preparación de aditivos a partir de productos lacteos

46 Promiscuidad Catalítica: Nuevas reaccionesViejas enzimas Single-enzyme multi-step conversions Nü Nü =Nucléophile

47 47 Catalytic promiscuity in enzymes is the ability of enzyme active sites to catalyze more than one chemical transformation Posibilidad de las enzimas para reaccionar sobre: Diferentes grupos funcionales Diferentes tipos de enlace Diferente mecanismo de reacción Angew. Chem. Int Ed. 2004, 43,

48 48 Reacciones de adición tipo Michael catalizadas por lipasas Formación de enlaces C-C Nucleófilo enlaceC-C Ataque nucleofílico Nucleófilos Electrófios

49 49 a) Torre, O.; Alfonso, I.; Gotor, V.; Chem. Commun. 2004, 1724; 14; b) Cai, Y.; Wu, Q.; Xiao, Y. M.; Lv, D. S.;Lin, X. F. J. of Biotech., °C Solvant organique

50 50 Mecanismo Clásico

51 51 Mecanismo propuesto para Ser-Hidrolasas Desplazamiento catalítico Acido de Lewis Transferencia de protón Acido-Base

52 52 But : Preparación de intermediarios de la síntesis de -aminoácidos con estereo quuimica específica

53 53 Esters insaturés Amines primaires (R) and (S) phenylethylamine AmmoniumBenzylamine

54 54 Figure 1. Hypothetical catalytic addition of benzylamine to methyl crotonate in the active site of CaL-B. The carbonyl oxygen of the, -unsaturated is bound to the oxyanion hole and the nucleophile is activated by His.

55 55 Adici ó n 1,4 Adici ó n 1,2 Doble Adici ó n 1,4 Posibles reacciones Se ha reportado la formación preferencial de amidas : Solventes no polares Bajas concentraciones de sustrato (Metil acrilato) Temperaturas 45 ºC

56 56 EntrySolventET (30) NMR Ratio % (3)% (4) 1n-Hexane Toluene DisoPropyl ether THF n-Hex:2M2B, 1: n-Hex:2M2B, 1: M2B Table 1. Influence of organic media on the reaction of 0.5 M of Benzylamine (1) and 0.75 M of Methyl crotonate (2) using 20 mg/mmol of CaL-B/(1), at 65 °C for 72 h.

57 57 Changes in polarity of reaction media describing the profile of (A) Michael adduct (3) and (B) aminolysis product (4) as a function of empirical polarity parameters E T (30).

58 58 Entry [a] [1] (M)% 3% 4(%)Conv [b] Final Conc. (M) (3) (4) 10.50>95< [ a] Substrate initial concentration ratio 1:1.5 (1) with respect to (2). [b] Determined by HPLC and referred to initial concentration of (1). Table 2. Influence of the initial concentration of (1) in n-hexane on the ratio of (3) and (4) determined by HPLC, after 72 h of reaction.

59 Aplicacion en química orgánica

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