Aplicaciones en Biotecnología

Presentación del tema: "Aplicaciones en Biotecnología"— Transcripción de la presentación:

1 Aplicaciones en Biotecnología
Las Lipasas : Aplicaciones en Biotecnología

2 Definición : Una “lipasa verdadera” (EC ) se define como una carboxilesterasa capaz de catalizar la hidrólisis y la síntesis de acilgliceroles de cadena larga, teniendo como sustrato standard a la trioleina. Acilglicerolhidrolasas o triacilglicerolhidrolasas

3 Origen de las lipasas: Las lipasas son enzimas ubicuas que pueden ser encontradas en: Microorganismos Plantas Animales Comercialmente en su mayoría son de origen microbiano Hongos Bacterias Levaduras Generalidades Peso molecular kD Contienen 2-15% de carbohidratos pH óptimo = 8-9 lipasas animales; microbianas Topt = oC

4 Lipasas disponibles comercialmente

5 Pureza de lipasas disponibles comercialmente
Origen de la lipasa % de proteína Actividad vs Trioleína U/mg Bandas SDS-PAGE kD bandas SDS-PAGE Número de bandas esterasa % de actividad proteolítica Rhizomucor miehei 3.5 16 25 5 2 1 Rhizopus spec. 4.8 32 43, 67 10 4 3 Humicola lanuginosa 2.9 20,30 20 Candida rugosa I 4.2 11 20,30,43,67,90 13 <1 Candida rugosa II 6.4 14 43,67 Geotrichum candidum 4.3 8 67 Pseudomonas fluorescens 1.2 30 14,25,40,43 6 C.viscosum I 1.1 45 17,30,40 C. viscosum II 9.5 154 12

6 Controversias en las propiedades de lipasas disponibles comercialmente
Origen de la lipasa Observaciones Candida rugosa (CRL) Inicialmente clasificado como Candida cylindracea, clonación y purificación de la proteína revela al menos cinco isoformas. Geotrichum candidum (GCL) Contiene dos isoformas que se diferencían en la especificidad cis o trans en acidos grasos insaturados Rhizopus (RAL, ROL,RDL, RNL) En la literatura se reportan diferentes especificidades aunque la clonación reveló identidad casi total. Penicillium camembertii (PeCL) Clasificada como lipasa de P. cyclopium hasta 1990, recientemente se encontraron cuatro isoformas que difieren principalmente en el patrón de glicosilación Pseudomonas glumae (PGL) Clonación y secuenciación reveló alta identidad con la lipasa de Chromobacterium viscosum (CVL). Pseudomonas cepacia (PCL) Reclasificada en 1995 como Burkholderia cepacia. Clonación y secuenciación reveló identidad con la lipasa de Pseudomonas. sp. ATCC21808 (PSL).

7 Clasificación reciente basada en los motivos conservados de su secuencia y en sus propiedades biológicas

8 Propiedades estructurales : Plegamiento común de las lipasas
Asp/Glu His Ser C 2 4 3 5 6 7 8 N A B D F Patrón de plegamiento / compuesto por un “core” de  hebras rodeado por helices  tipico de numerosas hidrolasas El sitio activo esta compuesto de una triada catalítica formada por Ser-His-Asp/Glu A diferencia de muchas enzimas el sitio catalítico no esta expuesto en la superficie, se encuentra cubierto por residuos hidrofóbicos En rojo se presentan los motivos comunes a todas las lipasas En blanco se presentan los motivos presentes en la mayoría de las lipasas Las hélices A y F están en el lado cóncavo de las hebras  La hélice D esta a menudo compuesta de una sola vuelta

9 Mecanismo de activación interfacial en las lipasas

10 Mecanismo de activación interfacial en las lipasas
C) estructura cerrada D)estructura abierta El sitio catalítico de muchas lipasas se encuentra cubierto por una “tapa” formada por un “loop” Este arreglo estructural hidrfóbico al interaccionar con superficies hidrofóbicas genera una estructura catalíticamente activa de tapa abierta Se localiza desde el N terminal o desde el C terminal Cutinasa (lipasa) no posee esta tapa

11 La presencia de la tapa cubriendo el sitio activo de las lipasas y el fenómeno de activación interfacial no adecuado para distinguir lipasas de esterasas. Varias enzimas tienen la tapa hidrofóbica pero no presentan activación interfacial p.e. Pseudomonas glumae, Pseudomonas aeruginosa, C.antarctica B, y lipasa pancreática, lipasa

12 Acceso al sitio catalítico de las lipasas
C) estructura cerrada D)estructura abierta Vista de arriba de la lipas de Mucor miehei En rojo zonas polares y en azul zonas hidrofóbicas En amarillo sitio activo

13 Sitio activo y especificidad en lipasas
Se han identificado cuatro sitios de reconocimiento del sustrato en el sitio activo : Un agujero oxianión y tres sitios de unión específica de los residuos acilo en los triglicéridos, sitios sn-1, sn-2, y sn-3 del glicerol sn3 RO OR sn1 sn2 La diferencia de tamaño y del balance hidrofóbico/hidrofílico en estos sitios determina la especificidad de cada lipasa Especificidad por el tamaño de la cadena acilada Regioespecificidad sn-1, sn-2, y sn-3

14 Mecanismo catalítico

15 Reacciones catalizadas por las lipasas
Hidrólisis O O + + H2O R2OH R1 OR2 R1 OH Esterificación Esterificación O O O + + + + R2O R2OH HOH HOH R1 R OH OH R1 OR2 Transesterificación O R3 OH O R1 OR2 O R1 OH + R3 OR2 + Acidólisis O R1 OR2 O + + + + R3OH R2OH Alcoholisis R1 OR3

16 (cont.) + + + + + + + + + + + + R3NH2 R2OH R2SH HOH HOH R3NH2 HOH
Interesterificación O R3 OR4 O R1 OR2 O R1 OR4 + R3 OR2 + Aminólisis O O O + R3NH2 + + R2OH R R1 OR2 R1 NHR3 Tioesterificación O O O + + + + R2SH HOH HOH R1 R OH OH R1 SR2 Amidación O O O + R3NH2 + + HOH R1 R OH R1 NHR3

17 Control del equilibrio termodinámico del proceso
Control del grado de acilación de polioles Monoésteres, Diésteres, Triésteres…….. -Emulsificantes para especialidades farmacéuticas -Vehículos para medicamentos -Bloques de construcción en síntesis orgánica

18 Control de la posición del equilibrio termodinámico
Actividad termodinámica: a = X  = coeficiente de actividad X = fracción mol El coeficiente de actividad termodinámica función del número del número y tipo de interacciones soluto-solvente

19 Control de la posición del equilibrio termodinámico en reacciones laterales
Bloqueo de la síntesis de di- y triésteres por aumento de sus coeficientes de actividad Favorecer la síntesis de monoésteres por disminución de sus coeficientes de actividad

20 Coeficiente de actividad alto = baja interacción soluto-solvente, baja concentración al equilibrio
Coeficiente de actividad bajo = alta interacción soluto-solvente, alta concentración al equilibrio

21 Glicerol + Ácido oléico en n-hexano
Síntesis enzimática de monooleína : Glicerol + Ácido oléico en n-hexano Buena solubilidad del ácido graso >0.5 M Compatibilidad de las enzimas con solventes hidrofóbicos Baja solubilidad del glicerol trioleina dioleina monooleina Rendimiento alto: 80% Baja selectividad por monoésteres Trioleina 70% Dioleina 27% -Monooleina 3%

22 Síntesis selectiva de monoésteres de polioles

23 Modelo de predicción de la síntesis selectiva de monoésteres de polioles
Cálculo teórico de los coeficientes de actividad por UNIFAC Calculo de las actividades termodinámicas de los productos al equilibrio Buena correlación del modelo con resultados teóricos

24 Síntesis selectiva de monooleina por glicerólisis
Se pueden alcanzar concentraciones de producto entre M Proceso que se puede realizar en reactor contínuo

25 Síntesis selectiva de ésteres de xilitol

26 Síntesis selectiva de ésteres de xilitol

27 Coeficiente de actividad en función del parámetro de polaridad ET30
Predicción de la abundancia de los prooductos en función de la polaridad del medio de reacción Evaluado para un gran número de mezclas de solventes (acetona, acetonitrilo, DMSO, hexano, 2M2P, ……..)

28 Control de la quimioselectividad del proceso
2M2B Amida 95% Ester 52% n-hexane Amida 54% Ester 95% Baja actividad termodinámica de ésteres en n-hexano Baja actividad termodinámica de amidas en 2M2B

29 Resolución de mezclas racémicas quimioselectivamente

30 Síntesis de inductores selectivos de apoptosis en células cancerosas
3-(4-Hydroxy-3-(S)-methoxy-phenyl)-N-[2-(4-hydroxy-phenyl)-2-methoxy-ethyl]- acrylamide Síntesis preferencial de amidas en 2M2B Reacción enantioselectiva

31 Decline of Traditional
The Chiral Market Market Share Forecast Growth of Biological Decline of Traditional

32 Enantioselectividad Poderosos Bloques de construcción en química orgánica 50% : (2R,4R) 25% : (2R,4S) 25% : (2S,4S) Enzimas mas utilizadas: Lipasas Esterasas Amidasas

33 Resolución cinética con lipasas
Evitar reversibilidad de la resolución

34 Generación de centros quirales por acilación
Bloques de construcción en síntesis orgánica Construcción de librerias Resolución de centros quirales (en polioles) Modelos moleculares para RMN

35 “Easy-On, Easy-Off Technology”
Sintesis-hidrólisis de amidas “Imposible” la hidrólisis de amidas con lipasas Proceso altamente enantioselectivo

36 Sistemas de reacción para las lipasas
SOLVENT SYSTEMS AND PROCESSES 1. Aqueous Reaction Media : Hidrolysis 2. Water: Water-Miscible Systems : Hydrolysis or Synthesis 3. Water: Water-Immiscible Systems : Hydrolysis or Synthesis 4. Nonaqueous Reaction Media : Synthesis 5. Anhydrous Reaction Media : Synthesis 6. Supercritical Fluids : Synthesis 7. Reverse Micellar Systems : Synthesis Sistemas con bajo 8. Solvent-Free Systems : Synthesis contenido de agua 9. Gas-Phase Catalysis : Synthesis 10. Ionic Liquids : Synthesis

37 PREPARATION OF MODIFIED LIPASES
Immobilization Adsorption onto solid supports such as silica gel Covalent attachment to solid supports Entrapment in organic polymers or microemulsions. B. Chemical Modification Cross-Linking : Use of glutaraldehyde to prepare insoluble cross-linked enzyme crystal (CLEC) P. cepacia and C. antarctica lipases for CLEC-catalyzed resolution of phenyl acetate (ALTUS-Biotech)

38 2. Modification with Polyethylene Glycol, Polymers and Surfactants
Enhanced stability of C. rugosa lipase in isooctane by treating the enzyme with p- nitrophenyl chloroformate and cyanuric acid chloride activated PEG. Alternative to PEG is to use the nonionic amphiphilic polyoxyethylene lauryl ether (Brij 35) as a covalent modifier Hydrophobic polymers such as polystyrene and polymethyl methacrylate or amphiphilic polymers such as poly N-vinylpyrrolidone Nonionic synthetic dialkyl amphiphiles or sorbitan monostearate (Span 60)

39 Aplicaciones industriales de las lipasas
Aplicaciones en oleoquímica : Hidrólisis de triglicéridos Disponibilidad de materia prima, 60 millones de tons de aceites y grasas por año. Cinco millones de toneladas para uso no alimentario La principal aplicación es la obtención de jabones, proceso químico El uso alternativo de las lipasas (hidrólisis de grasas y aceites) permite condiciones mas suaves, mejor calidad del producto y mejor rendimiento de glicerol como subproducto Miyoshi Yushi, en Nagoya, Japón, la única empresa en el mundo que usa esta tecnología con Candida rugosa lipase. Proceso en lote a 40 oC, durante 48 horas

40 Síntesis de metil- o etil- ésteres de ácidos grasos por alcoholisis : Biodiesel
An alternative source of energy for public transport is the so-called biodiesel, reduces sulfur oxide production. METHYL ESTERS OF FATTY ACIDS Produced chemically using oil from various plants (e.g. rapeseed). Alcohoysis catalyzed by KOH Can be catalysed in a single transesterification reaction using lipases in organic solvents. At an industrial scale failed so far because of the high cost of the appropriate biocatalyst. Two strategies were recently presented : Immobilisation of P. fluorescens lipase increased its stability even upon repeated use Cytoplasmic overexpression of Rhizopus oryzae lipase in Saccharomyces cerevisiae with subsequent freeze-thawing and air drying resulted in a whole-cell biocatalyst

41 + + Mejoramiento de la untabilidad de los aceites
Se puede modular el punto de fusión de una grasa por hidrogenación de dobles enlaces Un metodo alternativo es la incorporación de ácidos grasos saturados al aceite por interestificación enzimática sn3 RO OR sn1 sn2 sn3 XO OX sn1 sn2 sn3 RO OX sn1 sn2 sn3 XO OR OX sn1 sn2 + Lipase +

42 Síntesis de sustitutos de grasa de cacao
En ,000 toneladas de grasa de cacao fueron exportadas por Kenia y Malasia Grasa con demanda en alimentos y farmacia (Pf = 37 oC) sn3 XO OR OY sn1 sn2 Para X = oléico, Y = esteárico y R = palmítico Grasa de cacao compuesta de SOS o SOP primordialmente Interesterificación enzimática del aceite de palma (POP) o de girasol (OOO) con ácido esteárico o triesterarina (SSS). Uso de lipasas 1,3 específicas en proceso limpio Unichema (ICI) produce varios cientos de toneladas y Fuji Oil varios miles de toneladas utilizando lipasas de Rhizopus.

43 Grasas de alta digestibilidad
Mejoramiento en la absorción de triglicéridos Triglicéridos con palmítico en posición sn-2 mejor absorción sn3 XO OR OY sn1 sn2 Para X = palmítico Grasas de alta digestibilidad, p.e. leche materna Unichema produce OPO en dietas para niños prematuros por interestirificación de tripalmitina y ácido oléico Otro tipo de grasas de facil digestión son MLM (M=medium, L=long refiriendose al tamaño de cadena acilada) “Caprenin” (C6,C22:0,C8) producido por Procter&Gamble mediante síntesis química

44 Esterificación y glicerólisis
Síntesis de emulsificantes Monoglicéridos emulsificantes mas utilizados en la industria de alimentos 150,000 ton preparadas por glicerólisis química a partir de triglicéridos Los métodos enzimáticos incluyen : Esterificación y glicerólisis Bajos rendimientos y proceso económicamente desfavorable Necesidad de abaratar el costo del biocatalizador y aumentar su estabilidad operacional

45 Aplicaciones diversas (Hidrólisis)
Detergentes: Remoción de productos lipídicos Productos comerciales : Lipolasa de Novo-Nordisk, Lipomax de Gist-Brocades y Lumafast de Genencor. Industria papelera : Eliminación de triglicéridos de pulpa de celulosa o eliminación de tintas a base de lípidos en papel reciclado por Nihon Seishi Co., Industria de lacteos : mejorar la calidad de cuajadas, generación de aromas y sabores en quesos o preparación de aditivos a partir de productos lacteos

46 Promiscuidad Catalítica:
Nuevas reacciones Viejas enzimas Nü Nü =Nucléophile Single-enzyme multi-step conversions

47 Posibilidad de las enzimas para reaccionar sobre:
“Catalytic promiscuity in enzymes is the ability of enzyme active sites to catalyze more than one chemical transformation” Posibilidad de las enzimas para reaccionar sobre: Diferentes grupos funcionales Diferentes tipos de enlace Diferente mecanismo de reacción Angew. Chem. Int Ed , 43,

48 Reacciones de adición tipo Michael catalizadas por lipasas
Formación de enlaces C-C Nucleófilos Nucleófilo enlaceC-C Ataque nucleofílico Electrófios

49 50°C Solvant organique a) Torre, O.; Alfonso, I.; Gotor, V.; Chem. Commun. 2004, 1724; 14; b) Cai, Y.; Wu, Q.; Xiao, Y. M.; Lv, D. S.;Lin, X. F. J. of Biotech., 2006.

50 Mecanismo Clásico

51 Mecanismo propuesto para Ser-Hidrolasas
Acido de Lewis Transferencia de protón Acido-Base Desplazamiento catalítico

52 But : Preparación de intermediarios de la síntesis de b-aminoácidos con estereo quuimica específica

53 Esters a, b insaturés (R) and (S) phenylethylamine Ammonium Benzylamine Amines primaires

54 Figure 1. Hypothetical catalytic addition of benzylamine to methyl crotonate in the active site of CaL-B. The carbonyl oxygen of the ,-unsaturated is bound to the oxyanion hole and the nucleophile is activated by His.

55 Posibles reacciones Adición 1,4 Adición 1,2 Doble Adición 1,4
Se ha reportado la formación preferencial de amidas : Solventes no polares Bajas concentraciones de sustrato (Metil acrilato) Temperaturas ≈ 45 ºC

56 Entry Solvent ET(30) NMR Ratio % (3) % (4)
Table 1. Influence of organic media on the reaction of 0.5 M of Benzylamine (1) and 0.75 M of Methyl crotonate (2) using 20 mg/mmol of CaL-B/(1), at 65 °C for 72 h. Entry Solvent ET(30) NMR Ratio % (3) % (4) 1 n-Hexane 2 Toluene DisoPropyl ether 4 THF n-Hex:2M2B, 1: n-Hex:2M2B, 1: M2B

57 Changes in polarity of reaction media describing the profile of (A) Michael adduct (3) and (B) aminolysis product (4) as a function of empirical polarity parameters ET(30).

58 Table 2. Influence of the initial concentration of (1) in n-hexane on the ratio of (3) and (4) determined by HPLC, after 72 h of reaction. Entry[a] [1] (M) % 3 % 4 (%)Conv [b] Final Conc. (M) (3) (4) >95 < [a] Substrate initial concentration ratio 1:1.5 (1) with respect to (2). [b] Determined by HPLC and referred to initial concentration of (1).

59 Aplicacion en química orgánica

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Las Lipasas : Aplicaciones en Biotecnología