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Tema 12: Genómica Griffiths AJ et al., (2000) Klug WS y Cummings MR (2006) Links to Animal Genomic Research web site and Database Resources

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Presentación del tema: "Tema 12: Genómica Griffiths AJ et al., (2000) Klug WS y Cummings MR (2006) Links to Animal Genomic Research web site and Database Resources"— Transcripción de la presentación:

1 Tema 12: Genómica Griffiths AJ et al., (2000) Klug WS y Cummings MR (2006) Links to Animal Genomic Research web site and Database Resources Inma Martín-Burriel:

2 Contenidos Introducción Genómica estructural –Polimorfismos del DNA: tipos, metodología de estudio –Aplicaciones de los polimorfismos Genómica funcional

3 Definiciones Genómica es el conjunto de ciencias y técnicas dedicadas al estudio integral del funcionamiento, el contenido, la evolución y el origen de los genomas. Es una de las áreas más vanguardistas de la Biología. La genómica usa conocimientos derivados de distintas ciencias como son: biología molecular, bioquímica, informática, estadística, matemáticas, física, etc.genomasBiologíabiología molecular bioquímicainformáticaestadísticamatemáticasfísica Genomics is a discipline in genetics concerning the study of the genomes of organisms. The field includes intensive efforts to determine the entire DNA sequence of organisms and fine-scale genetic mapping efforts. The field also includes studies of intragenomic phenomena such as heterosis, epistasis, pleiotropy and other interactions between loci and alleles within the genome.genetics genomesDNA sequence genetic mappingheterosisepistasis pleiotropyalleles

4 Historia de la Genómica 1977: Secuenciación completa del genoma de nt del virus ØX174 (Sanger et al.) Desarrollo de métodos de secuenciación: secuencia de genomas eucarióticos.

5 , Allan Maxam y Walter Gilbert Métodos de terminación de la cadena o método de Sanger Pirosecuenciación Secuenciación a gran escala (NGS)

6 GENÓMICA EstructuralFuncional Comparativa Compara genomas de diversas especies para elucidar las relaciones funcionales y evolutivas. Desarrollo de organismos modelo de enfermedades Secuencia descubrimiento genes, localización Función de los genes Regulación

7 Genómica ESTRUCTURAL: –Caracterización de la naturaleza física de genomas completos FUNCIONAL: –Caracterización del proteoma y de los patrones globales de expresión génica Caracterización molecular de genomas completos

8 DNA eucariótico Genes funcionales de copia única DNA de secuencia repetida DNA separador Secuencias funcionales Secuencias sin función conocida Secuencias funcionales No codificantes Familias de genes codificantes (y pseudogenes asociados) Familias de genes dispersos Familias de genes en tándem Repeticiones heterocromatina Del centrómero VNTR Secuencias derivadas De transposiciones Transposones Retrotransposones Clasificación del DNA eucariota Genómica estructural Caracterización de la naturaleza física de genomas: - Polimorfismos del DNA - Cartografía

9 Polimorfismo genético Polimorfismo bioquímico: –Detección de variación al nivel del producto del gen: proteínas, enzimas Polimorfismos del DNA: –Variaciones presentes en la secuencia de bases Polimorfismos producidos por mutaciones puntuales Polimorfismos del número de repeticiones en tándem Polimorfismo: Variante genética que aparece en la población con una frecuencia > 1% morphisms.html

10 VNTR Tamaño (Kb) Unidad repetición Método detección Satélites kbCentrifugación ClCs Elec. campos pulsados Minisatélites0, pbElec. Agarosa Southern Microsatélitespb1-4pbElec. Acrilamida Secuenciación Polimorfismos debidos a variaciones en el número de repeticiones de DNA en tándem

11 DNA microsatélite (STR): –Short Tandem Repeat –Pequeñas formaciones (generalmente < 150pb) de repeticiones en tándem de secuencias muy simples (de 1 a 4 nucleótidos) –Repartidas por todo el genoma, normalmente en intrones. Frecuentes y altamente polimóficos (número medio de alelos 10) –Herencia mendeliana codominante CA Alelo 1 Alelo 2 Polimorfismos debidos a variaciones en el número de repeticiones de DNA en tándem

12 Visualización de los microsatélites ACGT Secuenciación: Genotipado:

13 Implicaciones de las secuencias microsatélites en patologías: –Expansión de microsatélites de trinucleótidos: Síndrome de X frágil (FMR-1) (CCG)n Distrofia miotónica (DM) (CTG)n Enfermedad de Huntington (HD) (CAG)n Ataxia de Friedreich (FA) Nueve formas de ataxia espinocerebelar (SCA) –Expansión de tetranucleótidos: DM2 –Expansión de pentanucleótidos: SCA10 Enfermedades humanas se han creado animales modelo

14 Secuencias de DNA dispersas ¿DNA basura? ¿DNA egoista? - ¿Regulación de la expresión? - ¿Puntos de recombinación? - Control de la segregación de cromosomas (centrómeros) - Estabilización de los cromosomas en la replicación (telómeros)

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16 ENCODE: Encyclopedia of DNA Elements: -Protein or non-coding RNA -Protein binding -Specific chromosome structure

17 Variación de un nucleótido en una posición determinada. Frecuencia:1/1000pb También conocidos como SNP (Single Nucleotide Polymorphisms) Polimorfismos debidos a mutaciones puntuales 1.Cambios de bases: a.Transiciones: i.Purina Purina: ii.Pirimidina Pirimidina: b.Transversiones i.Purina Pirimidina: ii.Pirimidina Purina Alelo 1 Alelo 2 TACGAGCTA TACGGGCTA AGPurinas TCPirimidinas

18 SNP: Single Nucleotide Polymorphisms: –Polimorfismo muy frecuente (1/300 pb) –10 a 30 millones de SNP en el genoma humano –Dos posibles alternativas en cada individuo –Herencia es muy estable (baja tasa de mutación vs de los microsatélites) –Fácil estandarización –Aplicaciones en la determinación de enfermedades y en farmacogenética

19 Detección de los SNP: –RFLP: Southern Blot PCR + RFLP –Secuenciación –Minisecuenciación –Sondas específicas –SSCPs –PCR en tiempo real… RFLPs –Detección mediante enzimas de restricción: Southern Blot PCR+RFLP –Normalmente determinados en exones RFLPs-SNP Origen: mutaciones puntuales Variabilidad: 2 alelos Localización: exones, intrones, regiones reguladoras, DNA espaciador

20 Detección de mutaciones puntuales RFLP: Alelo 1 Alelo 2 TGGACGTCT TGGATGTCT MCL1 Aat II Alelo 1 Alelo 2 Sonda

21 Detección de mutaciones puntuales Minisequencing

22 Marcador del DNA (genético) Gen o secuencia de DNA cuya localización en el genoma se conoce. Características: –Tienen que ser polimórficos (en la población). –Si es un gen no interesa la función sino las variaciones en el DNA (que pueden reflejarse en diferencias funcionales) (ej. Grupo sanguíneo). HAY POCOS GENES MARCADORES. –Las variaciones en un segmento de DNA se transmiten según las reglas Mendelianas de codominancia. HAY MUCHAS SECUENCIAS MARCADORES.

23 Tipos de marcadores SNP (or Single nucleotide polymorphism) RFLP (or Restriction fragment length polymorphism) RAD markers (or Restriction site associated DNA markers) AFLP (or Amplified fragment length polymorphism) VNTR (or Variable number tandem repeat) Microsatellite polymorphism, SSR (or Simple sequence repeat) STR (or Short tandem repeat) SSLP (or Simple sequence length polymorphism) RAPD (or Random amplification of polymorphic DNA) SFP (or Single feature polymorphism) DArT (or Diversity Arrays Technology)

24 Aplicaciones de los polimorfismos del DNA: –Diagnóstico genético –Identificación individual –Construcción de los mapas génicos –Ligamiento con fenotipos

25 Diagnóstico genético indirecto: Análisis de marcadores genéticos X Gen alterado Marcador polimórfico Mutación puntual Microsatélite RFLP Deleción Inserción Genotipo del marcador Genotipo del gen dañado

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28 Identificación individual: Marcadores fenotípicos (HLA, Gr. Sanguíneos) Análisis de marcadores microsatélites PCR, secuenciación Fingerprinting (minisat.) Detección mediante RFLP + Southern Microsatélites Minisatélites Control de filiación Control de libros genalógicos

29 Mapas del genoma: –Mapa genético Posiciones relativas de los genes entre si, sin anclaje físico Distancia entre marcadores determinada por la frecuencia de recombinación en la meiosis –Mapa físico Posición exacta de un gen Distancia entre marcadores determinada por nº de pb

30 Secuenciación de genomas Construcción de libreríasPCR en puente Secuenciación por síntesis

31 Análisis bioinformático (NGS) -Preprocesado de las secuencias -Control de calidad -Alineamiento de secuencias: formación de contigs -Alineamiento con las referencias -Búsqueda de variantes

32 Ligamiento con fenotipos Ligamiento: –Identificación de regiones del genoma con un nº de alelos compartidos en individuos afectados > al esperado (en familias) –Análisis de 500 pols –Regiones candidatas y acotamiento de la región –Alelos raros de alto riesgo Asociación: –Análisis de individuos afectados no emparentados e identificación de alelos compartidos –Facilidad para la obtención de muestras –Necesidad de analizar miles de marcadores –Alelos de acción modesta en enfermedades comunes

33 Secuenciación del Exoma -Alineamiento con secuencias de referencia -Eliminación de variantes comunes (dbSNP, HapMap8) -Secuenciando 3 o 4 individuos mutación causante -Riesgo de falsos negativos -Estudio de ligamiento + NGS (secuenciando familia e identificando los fragmentos cromosómicos heredados de los padres) -Confirmación con pruebas bioquímicas y funcionales

34 Genómica funcional Los datos de la secuenciación a gran escala son el punto de partida de la genómica funcional Búsqueda de ORF en secuencias de DNA desconocidas Identificación de su función Empleo de chips (microarrays) de DNA para estudio de regulación génica

35 Chips de DNA Muestras de DNA ordenadas, unidas a un chip de cristal del tamaño de un cubreobjetos En un chip puede haber miles de muestras (cDNA de genes conocidos) Los chips se exponen a muestras de mRNA marcados procedentes de distintos tejidos (distinta fase de desarrollo, tumoral vs normal, etc.) Se miden variaciones en la expresión de los tejidos

36 Algorithm overview, for paired-end RNA-Seq. Lee S et al. Nucl. Acids Res. 2010;nar.gkq1015 © The Author(s) Published by Oxford University Press. RNAseq

37 Aplicaciones de la Genómica Conocimiento y comprensión de procesos patológicos Precisión de diagnóstico: –Clasificación más fina (cáncer de colon, piel) –Farmacogenómica respuesta individual a tratamientos, elección de quimioterapia Evaluación correcta del riesgo genético: –Predicción de la agresividad tumoral Prevención conocido el riesgo genético –Comenzar planes de vigilancia en riesgo de cáncer, hipercolesterolemia, hemocromatosis,..

38 Análisis de recién nacidos Detección de portadores Desarrollo de terapias: –Terapia génica: reemplazar un gen alterado por el gen funcional –Terapia basada en la genética: Diseño de nuevas drogas Tratamientos basados en las bases moleculares Elección del tratamiento Identificación de genes con interés en producción. Implicaciones del conocimiento del genoma

39 Videos de genómica feature=related Jgcg&feature=related Exon Sequencing ns=em Microarray:


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