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Introducción a la espectroscopía vibracional Espectro electromagnético Frecuencia (Hz) Longitud de ondaTipo de radiaciónTipos de transición 10 20 - 10.

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1 Introducción a la espectroscopía vibracional Espectro electromagnético Frecuencia (Hz) Longitud de ondaTipo de radiaciónTipos de transición 10 20 - 10 24 10 -12 - 10 -16 mRayos gammaNuclear 10 17 - 10 20 1 nm - 1 pmRayos XElectrones internos 10 15 - 10 17 400 - 1 nmUltravioletaElectrones externos 4.3x10 14 - 7.5x10 14 700 - 400 nmVisibleElectrones externos 10 12 -10 14 2.5 µm - 700 nmInfrarrojoVibraciones 10 8 - 10 12 1 mm - 2.5 µmMicroondasRotaciones 10 0 - 10 8 10 8 - 1 mRadiofrecuenciaInversión de spin

2 Estados vibracionales y energía Frecuencia de la vibración k = constante de fuerza del enlaceF = -kx µ = masa reducida, para un sistema diatómico

3 cm -1 IRRAMAN estiramiento (sim) 1340-+ estiramiento (asim) 2349+- deformación667+- deformación667+- Modos normales de vibración (3N - 5) O O CO O C O O CO O C

4 INFRARROJO Reglas de selección: No todas las vibraciones serán activas en IR Sólo aquellas en las que cambie el momento dipolar permanente durante la vibración

5 INFRARROJO

6 N-H C-H C=O INFRARROJO

7 FTIR Espectrometría IR con Transformada de Fourier 1.Mejor relación señal/ruido ya que la luz no debe pasar por un monocromador. 2.Se miden todas las frecuencias a la vez lo que da mucha mayor rapidez 3.Puede tener una resolución de menos de 0.01 cm -1 4.Los espectros pasan necesariamente por una computadora lo que facilita el análisis y manejo espectral

8 CN C HC O estiramiento NH (3236 F)amida I (1653 F) amida II (1567 F)amida III (1299 M) amida IV (627 D)amida V (725 F) estiramiento NC (1096 D) estiramiento CN y CC (881 D) deformación CCN (436 D) deformación CNC (289 D) amida VI (600 M) amida VII (206 M) Modos normales de vibración del grupo amida (valores para metilacetamida)

9 antiparalela hélice transición ovillo estadístico Susi, H., Timasheff, S and Stevens, L. J Biol Chem (1967) 242, 5460-5466

10 Goormaghtigh, E; Ruysschaert, J. M. and Raussens, V Biophysical Journal Volume 90 April 2006 2946–2957 Estructura

11 Porcentajes de hélice y cadena extendida obtenidas por rayos X y FTIR Proteína% Hélice% Cadena extendida FTIRRXFTIRRX Carboxipeptidasa40393330 α-Quimotripsina12105049 Concanavalina A4260 Lisozima41452119 Papaína27293229 Ribonucleasa A21225046

12 1H2O1H2O 2H2O2H2O Efecto de la deuteración de la proteína sobre la posición de la banda amida I J. Biol. Chem. (1998) 273: 771-777

13 BIAP (A)apo BIAP (B)Asignación tentativa 1682 C=O amida I (hoja ) 1660 C=O amida I (giro) 1651–16521652 C=O amida I (hélice ) 1633 C=O amida I (hoja ) 1586–15771586–1571 C=O COO – Asp o Glu 1547 N-H amida II 1516–1517 OH anillo Tyr 14431455 N- 2 H amida II y 2 HOH Asignación tentativa de las diferentes bandas en el espectro FTIR de BIAP y apoBIAP en 2 H 2 O, pH 6.6

14 FTIR de monóxido de carbono unido a citocromo c aa3 de T. termophilus. Referencia: Pinakoulaki, E.; Soulimane, T. and Varotsis, C. (2002) J. Biol. Chem. 277:32867. Isótopos y posición de las bandas

15 Sir Chandrasekhara Venkata Raman, ( ) Tiruchirapalli, Tamil Nadu -7/11/1888 Bangalore, Karnataka - 21/11/1970 Premio Nobel de Física 1930 Efecto Raman Dispersión inelástica de fotones estados electrónicos virtuales

16 muestra Láser, luz monocromática Monocromador, espectrógrafo Regla de selección: Para que la vibración sea activa en Raman debe provocar un cambio en la polarizabilidad de la molécula. Ventajas de Raman con respecto a IR 1.Se mide en el visible o el UV donde los detectores son mucho más sensibles 2.El agua produce una dispersión Raman muy débil 3.La resonancia Raman permite sondear grupos asociados a cromóforos con una sensibilidad 10 2 - 10 4 veces mayor

17 N N

18

19 Resonancia Raman estado electrónico excitado estado electrónico basal estado energético virtual Raman Resonancia Raman La resonancia Raman es más intensa que la dispersión Raman, pero necesita que exista un cromóforo y sólo se intensifican las bandas debidas al cromóforo

20 Espectro IR de BSA sólida (azul) y espectro Raman de BSA en solución en amortiguador de fosfato (rojo).

21 Das, T. K., S. Mazumdar and S. Mitra (1998). Eur J Biochem 254(3): 662-70 = 406.7 nm


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