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AGROBIOTECNOLOGÍA Biotecnología Vegetal Ma. Mercedes Rivero

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Presentación del tema: "AGROBIOTECNOLOGÍA Biotecnología Vegetal Ma. Mercedes Rivero"— Transcripción de la presentación:

1 AGROBIOTECNOLOGÍA Biotecnología Vegetal Ma. Mercedes Rivero
Instituto de Ingeniería Genética y Biología Molecular (INGEBI) Programa de Biotecnología para América Latina y el Caribe Universidad de las Naciones Unidas

2 Biotecnología Vegetal
Cultivo in vitro de células, tejidos y órganos micropropagación mejoramiento de plantas producción de compuestos de interés comercial producción de metabolitos secundarios producción de proteínas producción de polímeros biodegradables establecimiento de plantas transgénicas plantas resistentes a virus plantas con rutas metabólicas modificadas plantas mejoradas en cuanto a composición de proteínas, aceites, etc. fitorremediación remoción de xenobióticos remoción de metales pesados

3 Sumario Técnicas del cultivo de células y tejidos vegetales
Micropropagación vegetal Consideraciones técnicas de la propagación clonal masiva de plantas Etapas del cultivo in vitro de plantas superiores Vías morfogenéticas: organogénesis y embriogénesis Sistemas de micropropagación vegetal Alcances de la propagación clonal masiva de plantas Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales Referencias

4 Técnicas del cultivo de células y tejidos vegetales
Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales

5 Principales conceptos fisiológicos aplicables a los cultivos in vitro
Existen tres conceptos básicos que fundamentan el cultivo in vitro de células y tejidos vegetales: - Totipotencialidad celular - Desdiferenciación / Rediferenciación - Balance de reguladores del crecimiento vegetal Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales

6 Fundamentos teóricos y prácticos del cultivo de tejidos vegetales
La teoría de la totipotencialidad celular, enunciada por Haberlandt a principios del siglo veinte, postula que toda célula vegetal individual es capaz de regenerar una planta entera a partir de un cultivo in vitro sin importar el grado de diferenciación alcanzado. Para ello se requieren condiciones específicas referidas al medio del cultivo, relaciones hormonales, temperatura, fotoperíodo, etc. La desdiferenciación consiste en la transformación y pérdida de las características de especialización de un tipo celular para dar lugar a células de tipo meristemático. El siguiente paso involucrado en la regeneración de una planta es la rediferenciación de las células previamente desdiferenciadas. Todo proceso de diferenciación está regulado por el balance entre diferentes tipos de reguladores del crecimiento, fundamentalmente de auxinas y citocininas. Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales

7 del cultivo de células y tejidos vegetales
Técnicas del cultivo de células y tejidos vegetales Micropropagación vegetal Regeneración de plantas (embriogénesis y organogénesis) Cultivo de meristemos Cultivo de suspensiones de células vegetales Cultivo de protoplastos Cultivo de anteras Cultivo de óvulos y embriones Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales

8 Micropropagación vegetal
Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales

9 La micropropagación constituye la principal aplicación comercial del cultivo de tejidos vegetales
La micropropagación vegetal, o propagación clonal masiva de plantas superiores, posibilita la obtención y cultivo de plantas a gran escala. Se realiza bajo estrictas condiciones de esterilidad en un medio sintético nutritivo y con control de temperatura, luz y fotoperíodo. Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales

10 Consideraciones técnicas de la propagación clonal masiva de plantas
Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales

11 y de condiciones controladas de cultivo Laboratorio
La micropropagación vegetal requiere disponer de una infraestructura mínima especializada y de condiciones controladas de cultivo Laboratorio - Area de preparación de medios. - Area de lavado y esterilización. - Cuarto estéril. - Cámara de cultivo. - Area de rusticación. Material vegetal - Plantas madres seleccionadas (pre-acondicionamiento). - Explantes (elección, disección, esterilización, etc.). Condiciones de cultivo - Asepsia. - Recipientes. - Temperatura. - Luz y fotoperíodo. Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales

12 Medios de cultivo: composición general
Compuestos inorgánicos Macronutrientes: NO3- , PO43- , K+, Ca2+, Mg2+, SO42- Micronutrientes: Fe2+, Cu2+, Zn+, Mn2+, Mo2+, Co2+, I- Carbohidratos Sacarosa, glucosa, mio-inositol Vitaminas Tiamina (B1) Piridoxina Acido nicotínico (C) Biotina Aminoácidos Glicina Reguladores del crecimiento Auxinas Citocininas Giberelinas Soporte inerte (medios semisólidos) Agar (0,7 a 1%) Gelrite® pH 5,6 – 5,8 Esterilización 1 atmósfera, 15 a 20 minutos en autoclave

13 para tejidos vegetales
Formulación básica de un medio de cultivo para tejidos vegetales Soluciones concentradas de macroelementos (100x) Soluciones concentradas de microelementos (100x) Vitaminas grupo B (500 ó 1000x) Mio-inositol (100 mg/L) Azúcares: Generalmente sacarosa o glucosa en concentraciones de aproximadamente 30 g/L. Agar-agar: hidrato de carbono de alto peso molecular extraído a partir de algas. Se usa entre 5 y 10 g/L Soluble en agua a 90ºC. Permanece fundido hasta los 40ºC, temperatura por debajo de la cual solidifica en la forma de un gel transparente, más o menos sólido dependiendo de la concentración. los tejidos o células cultivados in vitro presentan una tasa fotosintética reducida o inhibida por lo que resulta necesario aportarles una fuente de carbono Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales

14 Consistencia del medio
Propiedades físicas de los medios de cultivo Semisólido Consistencia del medio Líquido El metabolismo de los tejidos puede modificarse dependiendo de las características del medio de cultivo (líquido o semi-sólido). En el caso de un medio sólido, la concentración y calidad del agar pueden tener importantes efectos en el desarrollo del cultivo (hiperhidricidad, crecimiento lento, etc.). El cultivo en medio líquido resulta imprescindible cuando la propagación in vitro es desarrollada a través de las siguientes vías: - Inducción de embriogénesis*. - Cultivo de protoplastos. Cultivo de suspensiones celulares. *también en medio semisólido Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales

15 Propiedades físicas de los medios de cultivo Intercambio gaseoso: pH:
Los recipientes de cultivo se tapan con una película de polietieleno (Resinite) para posibilitar el intercambio de gases. La organogénesis puede verse modificada si el intercambio de gases se ve dificultado. - La inducción de yemas a partir de callos de tabaco se reduce si no hay suficiente oxígeno. - La acumulación de etileno puede inhibir la regeneración de brotes. pH: - Constituye un factor crítico. - Se ajusta en el rango 5,5 – 5,8. - Se modifica durante el crecimiento de los cultivos. Propiedades físicas de los medios de cultivo Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales

16 Composición de medios de cultivo comúnmente usados

17 Composición de medios de cultivo comúnmente usados

18 Reguladores del crecimiento comúnmente usados
en los medios de cultivos vegetales

19 Reguladores del crecimiento
Grupos básicos de reguladores del crecimiento: Auxinas Citocininas Giberelinas Acido abscísico - Etileno Generalidades: - Actúan a bajas concentraciones - Interactúan unos con otros (los resultados están determinados por las concentraciones relativas entre las diferentes fitohormonas). - Los reguladores endógenos del crecimiento están presentes en la planta durante todo su ciclo de vida pero su concentración fluctúa. Su concentración relativa varía en función del estado fisiológico de la planta y en cada uno de los órganos de ésta. - Están involucrados en numerosos procesos fisiológicos. Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales

20 Auxinas: estos compuestos se emplean básicamente como promotores de la proliferación celular y la inducción de la morfogénesis N OH O Acido indol acético (AIA) (auxina endógena) Las auxinas fueron descubiertas entre 1933 y 1935 a partir de bioensayos realizados para caracterizar el mensajero químico responsable de la elongación y de la respuesta fototrópica del coleóptilo de gramíneas. - Alargamiento y división celular - Crecimiento de secciones de hojas, tallos y frutos - Formación de raíces adventicias - Dominancia apical - Acción herbicida - Estimulación de la producción de etileno Se sintetizan en las yemas, las hojas jóvenes, los frutos y en el embrión. La concentración endógena en la planta varía entre 0,001 y 0,1 mg·Kg-1. Su transporte es polar Auxinas sintéticas: - Acido indol butírico (IBA) - Acido naftalen acético (ANA) - 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D) Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales

21 Citocininas: en combinación con las auxinas, determinan diferentes respuestas morfogenéticas
Fueron descubiertas en 1955 estudiando sustancias promotoras de la división celular in vitro. Están involucradas en variadas respuestas fisiológicas: - Promoción de la división celular - Promoción de la organogénesis (relación auxinas/citocininas) - Retardo de la senescencia - Síntesis de clorofila y desarrollo de cloroplastos Citocininas endógenas: - Zeatina (Zea) - Isopenteniladenina (2iP) Citocininas sintéticas: - Cinetina (Kin) - Benziladenina (BAP) Se sintetizan en el embrión y las raíces; se encuentran en todos los tejidos. La concentración endógena en plantas varía entre 0,1 y 500 g·Kg-1. Su transporte es no polar. Biorreactor de tambor rotatorio: Este tipo de fermentador es menos tradicional, pero ha permitido establecer cultivos de alta densidad con buenos rendimientos. Consiste de un vaso cilíndrico en posición horizontal que gira sobre su eje. Posee además deflectores que le permiten un mejor mezclado. El giro del cilindro forma una capa de liquido delgada sobre las paredes del tambor mejorando la transferencia de oxígeno; a su vez el aire es burbujeado por debajo de la superficie de las suspensiones celulares. Tanaka et al. (1987) lograron con este tipo de biorreactor mejores rendimientos que los logrados con otros tipos de fermentadores (agitación mecánica y airlift) en la producción de shikonina, gracias a la buena transferencia de oxígeno y a la baja generación de fuerzas de corte. También se notó menos adhesión de células en las paredes del bioreactor. Biorreactores de membrana: En los reactores donde el aire es suministrado en burbujas, las células suelen flotar en la superficie creando una zona con mucha formación de espuma. Si el mezclado no es homogéneo, en estas zonas suele crecer biomasa. Para evitar este problema, la aireación puede suministrarse a través de membranas hidrofóbicas de fibra hueca, las que no producen burbujas. Este sistema ha sido originalmente diseñado para células animales. La desventaja que presenta es que las células vegetales suelen crecer entre las fibras tapándolas y dificultando la transferencia de oxígeno. Bohme et al. desarrollaron un sistema parecido con membranas de polipropileno, pero dejando un espacio entre las membranas mayor que el tamaño de los agregados celulares, evitando así el crecimiento entre las fibras. La biomasa obtenida de células de Aesculus hippocastacum fue de 10 g de peso seco/L. Referencias: Payne, G.F., Bringi, V., Prince, C. and Shuler, M.L.. Suspension Culture. En: Plant cell and tissue cultures en liquid systems. (ed: Payne, G.F., Bringi, V., Prince, C. and Shuler, M.L.), pp: , Munich Hanser Publishers, 1991. Scragg, A.Bioreactors for the mass cultivation of plant cells. En: Plant Biotechnology. (ed.: Fowler, M.; Warren, G. and Moo-Young, M.), pp: 45-62, Pergamon Press, 1992. Kieran, P.; MacLoughlin, P. and Malone, D. Plant cell suspension cultures: some engineering considerations. Journal of Biotechnology, 59:39-52,1997. Su, WW. Bioprocessing technology for plant cell suspension cultures. Applied Biochemistry and Biotechnology, 50: , 1995. Tanaka, H. Large scale cultivation of plant cells at high density: a review. Process Biochemistry, 22: , 1987. Bohme, C.; Schroder, M.; Jung-Heiliger, H. and Lehmann, J.Plant cell suspension culture in a bench-scale feremnter with a newly designed membrane stirrer for bubble free aeration. Applied Microbiology Biotechnology, 48: ,1997. Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales

22 Estructura química de las principales citocininas
Agitación, Estrés por Fuerzas de Corte y Aireación Las células vegetales tienen un tamaño mayor a las células microbianas, además las paredes celulares suelen ser más delgadas que las células normales presentes en la planta entera, por lo tanto son más sensibles a las fuerzas de corte que se generan en los bioreactores. La fuerza hidrodinámica causada por la agitación responsable de este estrés debe ser tal que no cause la muerte celular pero que permita un adecuado mezclado en el bioreactor. Si bien se han seleccionado líneas resistentes a las fuerzas de corte, se han observado otros efectos como caída en la producción, cambios en el tamaño de los agregados y las interacciones celulares. Biorreactores con agitación mecánica: En este tipo de reactores, la mezcla y dispersión de las burbujas de aire se realiza por agitación mecánica, lo cual requiere invertir una gran cantidad de energía por unidad de volumen. En este caso, el agitador cumple dos funciones: a) asegurar la homogeneidad del medio mediante un mezclado eficiente y, b) romper las burbujas de aire para mejorar la transferencia de oxígeno. Los deflectores, o baffles, se utilizan para evitar la formación de vórtices. Existen una gran variedad de agitadores y tipos de fermentadores. Generalmente la relación entre altura y diámetro suele ser de 1, aunque si se quiere aumentar el tiempo de residencia de las burbujas dentro del mismo esta relación puede aumentarse. Estos biorreactores son los más usados en la industria, ya que permiten un buen mezclado y una buena transferencia de oxígeno. La desventaja que presentan es que, para evitar ruptura celular por las fuerzas de corte, se requiere bajar la velocidad de agitación. Esto puede aparejar una transferencia de masa menos eficiente, pudiéndose generar gradientes de nutrientes a lo largo del biorreactor. Para evitar este fenómeno, en lugar del agitador de palas planas usado más comúnmente que genera flujos radiales, puede usarse un agitador de tipo marinero que produce un flujo de tipo axial y menos fuerzas de corte. Referencias: Doran, P. Design of mixing systems for plant cell suspensions in stirrer reactors, 15: , 1995. Kieran, P.; MacLoughlin, P. and Malone, D. Plant cell suspension cultures: some engineering considerations. Journal of Biotechnology, 59:39-52,1997. Su, WW. Bioprocessing technology for plant cell suspension cultures. Applied Biochemistry and Biotechnology, 50: , 1995. Tanaka, H. Large scale cultivation of plant cells at high density: a review. Process Biochemistry, 22: , 1987.

23 Las giberelinas se utilizan para favorecer el crecimiento y el alargamiento de los entrenudos de los brotes de novo Acido giberélico (GA3) Aisladas del hongo Gibberella fujikuroi, a partir de plantas de arroz infectadas. Estas plantas presentaban marcada clorosis y largos entrenudos. Los primeros ensayos se llevaron a cabo usando extractos solubles del hongo. El ácido giberélico (GA3) fue la primera giberelina identificada. En la actualidad se conocen alrededor de 50 diferentes giberelinas. Algunos efectos mediados por las giberelinas son: - Promoción del crecimiento en plantas de genotipos enanos o plantas bianuales Crecimiento de yemas latentes Germinación de semillas en dormancia - Floración - Movilización de reservas en la semilla. Se sintetizan en hojas jóvenes, yemas y en el embrión. Su transporte no es polar. En biología vegetal, la elicitación es una respuesta de defensa a un estrés biológico, químico o físico que generalmente se traduce en la síntesis de moléculas de pequeño peso molecular llamadas fitoalexinas (metabolitos secundarios). Los agentes causantes de estas respuestas se denominan elicitores. Los elicitores alteran el metabolismo de las plantas o de los cultivos vegetales induciendo la expresión de enzimas responsables de la síntesis de metabolitos secundarios que actúan en la defensa de las plantas. Originalmente el término elicitor se refirió a extractos crudos de paredes celulares de hongos y luego se extendió a diversos agentes bióticos y abióticos. Dentro de los agentes bióticos se encuentran las paredes celulares de los microorganismos, los polímeros de glucano, distintas glicoproteínas y variados compuestos orgánicos de bajo peso molecular. Los agentes abióticos pueden ser la radiación UV, los metales pesados, el ultrasonido, etc. La elicitación es el resultado entre la interacción de la molécula elicitora y los receptores presentes en las membranas de las células vegetales. Esta interacción dispara un mecanismo de transducción de señales que finalmente induce la formación del metabolito secundario. Referencias: Payne, G.F., Bringi, V., Prince, C. and Shuler, M.L.. Immobilized plant cells. En: Plant cell and tissue cultures en liquid systems. (ed: Payne, G.F., Bringi, V., Prince, C. and Shuler, M.L.), pp: , Munich Hanser Publishers, 1991. Yeoman, M.; Holden, M.; Corchet, P.; Holden, P.; Goy, J. and Hobbs, M. Exploitation of disorganized plant cultures for the production of secondary metabolites. En: Secondary products from plant tissue culture (ed.: Charlwood, B. and Rhodes, M.J.C.), pp: , Oxford University Press, 1990. Singh, G. Application of fungal elicitation for enhancing production of secondary metabolites. En :Hairy Roots, Culture and Application (Ed by P. Doran), pp: , Harwood Academic Publishers, Amsterdam, The Netherlands, 1997. Bourgaud, F., Cravot, A. Milesi, S. and Gontier, E. Production of plant secondary metabolites: a historical perspective. Plant Science, 161: , 2001. Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales

24 Etapas del cultivo in vitro de plantas superiores
Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales

25 Etapas de la micropropagación vegetal
Iniciación - Elección y fitoacondicionamiento de la planta madre - Elección del explante inicial y de la formulación del medio de cultivo - Desinfección superficial de los explantes - Establecimiento del cultivo in vitro Multiplicación - Multiplicación del material stock Enraizamiento - Enraizamiento de los brotes obtenidos in vitro Rusticación - Pasaje de las plantas crecidas in vitro a las condiciones de maceta o a campo Etapas de la micropropagación vegetal Liberación del producto al medio: En la mayoría de los casos los metabolitos secundarios se acumulan intracelularmente. Esto representa una desventaja para la posterior extracción y purificación, ya que es necesario destruir la biomasa obtenida. Como se ha visto, debido a la lenta velocidad de crecimiento de los cultivos vegetales, la biomasa es particularmente valiosa. Para liberar el producto al medio, y al mismo tiempo conservar una biomasa viable y con capacidad biosintética intacta, se han descripto distintos métodos que utilizan agentes o tratamientos permeabilizantes. Algunos de los agentes y tratamientos utilizados son: a) dimetilsulfóxido (DMSO); b) choque térmico; c) cambios de pH; d) restricción de fosfato y oxígeno; e) elicitación; f) detergentes como Tritón X100 y Tween 20; g) aceites de siliconas; h) electropermeabilización (proceso similar a la electroporación). Estos tratamientos se aplican en conjunto con algún proceso de remoción in situ como los que se describen en las transparencias siguientes. Referencias: Bourgaud, F., Cravot, A. Milesi, S. and Gontier, E. Production of plant secondary metabolites: a historical perspective. Plant Science, 161: , 2001. Kieran, P.; MacLoughlin, P. and Malone, D. Plant cell suspension cultures: some engineering considerations. Journal of Biotechnology, 59:39-52,1997. Payne, G.F., Bringi, V., Prince, C. and Shuler, M.L.. Immobilized plant cells. En: Plant cell and tissue cultures en liquid systems. (ed: Payne, G.F., Bringi, V., Prince, C. and Shuler, M.L.), pp: , Munich Hanser Publishers, 1991. Payne, G.F., Bringi, V., Prince, C. and Shuler, M.L.. Root Cultures. En: Plant cell and tissue cultures en liquid systems. (ed: Payne, G.F., Bringi, V., Prince, C. and Shuler, M.L.), pp: , Munich Hanser Publishers, 1991. Sim, S.; and Chang, H.Shikonin production by hairy roots of Lithhospermum erythrorhizon in bioreactors with in situ separation. En :Hairy Roots, Culture and Application (Ed by P. Doran), pp: , Harwood Academic Publishers, Amsterdam, The Netherlands, 1997. Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales

26 de brotes y/o plantas completas
Existen dos posibles vías morfogenéticas implicadas en la diferenciación de novo de brotes y/o plantas completas Posibles vías morfogenéticas: - Organogénesis - Embriogénesis Diferencias entre las dos posibles vías: - La organogénesis es de origen pluricelular. Un grupo o cluster de células del explante inicial se desdiferencía inicialmente para luego rediferenciarse dando lugar a un órgano vegetal. No se obtienen por esta vía plantas completas directamente. - La embriogénesis se presupone de origen unicelular. Una célula del explante se aísla y constituye el punto de partida para la obtención de un embrión somático. Se diferencian embriones o estructuras bipolares que completan cada una de las etapas implicadas en la ontogenia de un embrión cigótico. El resultado es una planta completa. Remoción de producto in situ: Básicamente, consiste en agregar un compartimento artificial donde se acumule el metabolito de interés. Este compartimento extra se denomina segunda fase. El objetivo consiste en remover el compuesto del medio evitando la inhibición por retroalimentación negativa o su degradación. También permite una mejor separación y purificación del producto. Los sistemas de remoción pueden ser: Líquido-líquido: a) Compuestos inmiscibles en agua como solventes orgánicos o lípidos (sistemas de dos fases agua-orgánico); b) compuestos miscibles en agua, como sales o soluciones de polímeros (sistemas de dos fases acuosas). Sólido-líquido: La segunda fase es un material sólido como resinas de intercambio iónico (XAD, RP18, etc.) u otros absorbentes. Los compuestos a utilizar en el proceso de remoción debe ser autoclavables, no tóxicos, fácilmente separables del producto de interés y no debe alterar el medio de cultivo. Las células deben permanecer en la fase acuosa. Los sistemas de dos fases agua-orgánico más utilizados comprenden solventes orgánicos biocompatibles. Algunos de estos son decano, dodecano, hexadecano, FC 40, etc. Las dos fases acuosas no son muy usadas para metabolitos secundarios ya que éstos son de peso molecular pequeño. Serían más aptas para el caso de producción de proteínas por cultivo in vitro. Referencias: Bourgaud, F., Cravot, A. Milesi, S. and Gontier, E. Production of plant secondary metabolites: a historical perspective. Plant Science, 161: , 2001. Kieran, P.; MacLoughlin, P. and Malone, D. Plant cell suspension cultures: some engineering considerations. Journal of Biotechnology, 59:39-52,1997. Payne, G.F., Bringi, V., Prince, C. and Shuler, M.L.. Immobilized plant cells. En: Plant cell and tissue cultures en liquid systems. (ed: Payne, G.F., Bringi, V., Prince, C. and Shuler, M.L.), pp: , Munich Hanser Publishers, 1991. Payne, G.F., Bringi, V., Prince, C. and Shuler, M.L.. Root Cultures. En: Plant cell and tissue cultures en liquid systems. (ed: Payne, G.F., Bringi, V., Prince, C. and Shuler, M.L.), pp: , Munich Hanser Publishers, 1991. Sim, S.; and Chang, H.Shikonin production by hairy roots of Lithhospermum erythrorhizon in bioreactors with in situ separation. En :Hairy Roots, Culture and Application (Ed by P. Doran), pp: , Harwood Academic Publishers, Amsterdam, The Netherlands, 1997. Bassetti, L.; Buitelaar, R. and Tramper, J. Hairy roots of Tagetes in two- phase systems En :Hairy Roots, Culture and Application (Ed by P. Doran), pp: , Harwood Academic Publishers, Amsterdam, The Netherlands, 1997. Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales

27 en el protocolo de micropropagación de una especie vegetal
Etapas implicadas en el protocolo de micropropagación de una especie vegetal Elección de una planta madre selecta Explantes ETAPA 1 Desinfección superficial Establecimiento en medio de cultivo apropiado Transferencia a un medio de multiplicación ETAPA 2 Formación de brotes o embrioides Transferencia a un medio para el enraizamiento de los brotes Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales ETAPA 3 Pasaje a maceta en un invernadero ETAPA 4

28 Elección del explante inicial

29 Los explantes deben ser esterilizados antes de ser establecidos en condiciones de cultivo
Protocolo tipo de esterilización superficial de material vegetal: - Etanol 70%, entre 5 y 10 segundos. - Solución de hipoclorito de sodio (NaCIO) al 5 a 20%, entre 5 y 30 min Este paso puede ser reemplazado por el uso de soluciones diluídas de bicloruro de mercurio (HgCl2), entre el 0,01 y 0,05%. - Enjuagues con abundante agua estéril (4 ó 5 veces). - En el caso del HgCl2, el material se debe enjuagar sucesivas veces pues es difícil de eliminar. Nota: La esterilización es superficial. Las contaminaciones bacterianas endógenas pueden ser eliminadas usando antibióticos adicionados al medio de cultivo. Por ejemplo: - Carbenicillina 100 ug/ml - Rifampicina 20 ug/ml Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales

30 Posibles respuestas de los cultivos vegetales in vitro

31 organogénesis y embriogénesis
Vías morfogenéticas: organogénesis y embriogénesis Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales

32 Propagación vegetativa por embriogénesis somática
Las modificaciones introducidas en los biorreactores para la extracción in situ de productos comprende dos variantes básicas. Puede agregarse una segunda fase en el mismo bioreactor para concentrar en ella los productos, o bien puede reciclarse el medio de cultivo a través de un recipiente o columna donde se está presente la segunda fase y se produce la remoción del producto. La transparencia muestra dos ejemplos de diseño de biorreactores con las características descriptas. Referencias: Sim, S.; and Chang, H.Shikonin production by hairy roots of Lithhospermum erythrorhizon in bioreactors with in situ separation. En :Hairy Roots, Culture and Application (Ed by P. Doran), pp: , Harwood Academic Publishers, Amsterdam, The Netherlands, 1997. Bassetti, L.; Buitelaar, R. and Tramper, J. Hairy roots of Tagetes in two- phase systems En :Hairy Roots, Culture and Application (Ed by P. Doran), pp: , Harwood Academic Publishers, Amsterdam, The Netherlands, 1997.

33 Embriogénesis: Obtención de semillas artificiales
Semillas sintéticas de orquídea obtenidas por encapsulación en alginato

34 Sistemas de micropropagación vegetal

35 Sistemas de micropropagación vegetal
Proliferación de yemas axilares o apicales Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales

36 Propagación vegetativa a partir de yemas preexistentes
Proliferación de yemas apicales o axilares - Consiste en la multiplicación de plantas a partir de las yemas axilares preexistentes. Representa la aceleración in vitro del crecimiento natural de dichos meristemos. - La tasa de multiplicación (t.m.) se calcula con base en el número de brotes o vástagos obtenidos a partir de un explante inicial, entre una resiembra y otra sucesiva. Esta tasa puede variar entre 2 y brotes por mes, dependiendo de la especie en cuestión, entre otras variables. - Por ejemplo, con una t.m. de 5/mes podrían obtenerse plantas en un solo año, a partir de una única yema inicial. - El cultivo de meristemos es un caso especial del uso de esta técnica. Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales

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38 Sistemas de micropropagación vegetal
Proliferación de tejidos desdiferenciados Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales

39 Resulta posible regenerar brotes o yemas a partir de tejidos vegetales desdiferenciados
in vitro Consideraciones generales: - Callo: masa de células desdiferenciadas obtenidas a partir de un explante cultivado in vitro (disco de hoja, meristemo, células en suspensión, etc.) - Es posible regenerar brotes o vástagos a partir de estos callos. - Las plantas diferenciadas pueden no ser uniformes, debido al posible desarrollo de variantes somaclonales. Esto debe tenerse en cuenta, especialmente cuando se trabaja en propagación clonal a gran escala. Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales

40 Sistemas de propagación vegetativa in vitro Regeneración directa e indirecta

41 Sistemas de propagación vegetativa
in vitro Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales

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43 Sistemas de micropropagación vegetal Cultivo de meristemos
Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales

44 Los meristemos son grupos de células indiferenciadas que retienen
la capacidad de dividirse durante todo el ciclo de vida de una planta Los meristemos determinan el crecimiento de la planta y dan origen a sus diferentes órganos Posibilitan la micropropagación de diferentes especies vegetales. Constituyen el explante ideal para liberar de patógenos in vitro a plantas infectadas por virus, hongos y/o bacterias. Son ampliamente utilizados como explantes para la criopreservación y conservación de germoplasma. Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales

45 se reconocen diferentes tipos de meristemas
En el cuerpo de una planta se reconocen diferentes tipos de meristemas Meristemos apicales - Están localizados en la porción terminal o distal del vástago y de la raíz. - Sus divisiones dan lugar a las células de los tejidos pimarios del tallo y la raíz. - Son organogénicos. - Determinan el crecimiento en largo de tallos y raíces. Meristemos secundarios - Determinan el crecimiento radial de los órganos vegetales. - Dan lugar a los tejidos de conducción. Meristemos florales - Derivan de la transformación de meristemos apicales. - Se limitan a la producción de órganos florales. Meristemos intercalares - En el curso del desarrollo de la planta, persisten restos de los meristemos apicales intercalados en los tejidos maduros. - Determinan el crecimiento en largo de tallos y raíces Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales

46 de los meristemos como explantes del cultivo in vitro constituye
El empleo de los meristemos como explantes del cultivo in vitro constituye una posible herramienta para el saneamiento de plantas infectadas Cultivo de meristemas Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales

47 El cultivo de meristemos facilita la eliminación de patógenos
- El domo meristemático no está vascularizado (muchos patógenos se translocan por los tejidos de conducción). - El número de partículas virales es menor en los meristemos que en otros tejidos (White, 1934). - La velocidad de división celular a nivel del meristema es mayor que la velocidad de replicación de un virus. - Las primeras plantas saneadas a partir del cultivo de meristemos fueron obtenidas por Morel y Martin entre 1952 y a partir de cultivos de papa y Dahlia. Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales

48 Aspectos técnicos Asp del cultivo de meristemas Equipamiento
- Elementos generales para cultivo in vitro. - Lupa estereoscópica. - Instrumental de disección. Etapas del cultivo - Elección del explante: escencialmente meristemos apicales de vástago. Domo meristemático desnudo o acompañado por 2 ó 3 pares de primordios foliares. Tamaño aproximado 0,5 mm. - Esterilización de la yema o porción apical del vástago conteniendo al meristemo propiamente dicho. - Disección del meristemo bajo lupa. Eliminación de las primeras hojas. - Transferencia del explante al medio de cultivo semi-sólido. - Regeneración de yemas axilares. Subcultivo a medio sin hormonas para la obtención de plantas completas. - Propagación del material (a partir de estacas uninodales, etc.) - Rusticación. Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales

49 Consideraciones prácticas sobre el cultivo de meristemos
La eficiencia del cultivo de meristemos como procedimiento para la obtención de plantas sanas dependerá del tamaño del explante. Existe una situación de compromiso entre el tamaño mínimo posible del meristemo y su capacidad de desarrollar y prosperar durante el cultivo in vitro. Ejemplos prácticos: - Frutilla (Fragaria sp) / ¿patógeno?: Explantes de 0,22 mm; 100% de plantas sanas. - Papa (Solanum tuberosum) / Potato virus X: Explantes de 0,1 mm (o menor); 10% de plantas sanas. Si el explante incluye 2 pares de primordios el % de plantas sanas es menor. - Papa (Solanum tuberosum) / Potato virus Y o V: Se obtienen altas eficiencias de saneamiento cultivando explantes de no más de 2 pares de primordios foliares. Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales

50 Alcances de la micropropagación vegetal
Propagación vegetativa rápida y a gran escala Uniformidad seleccionada del material clonado Multiplicación de plantas recalcitrantes a las técnicas convencionales Reducción en el tiempo de multiplicación y en el espacio requerido para tal fin Mayor control sobre la sanidad del material propagado Introducción rápida de nuevos cultivares Conservación de germoplasma Facilidades para el intercambio internacional de material vegetal Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales

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