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IMPLEMENTACIÓN DE UN ENSAYO PCR MULTIPLEX PARA LA IDENTIFICACIÓN DE LAS ENTEROVARIEDADES DE Escherichia coli PATÓGENAS Autora: Andrea Zambrano Cobos Directora:

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1 IMPLEMENTACIÓN DE UN ENSAYO PCR MULTIPLEX PARA LA IDENTIFICACIÓN DE LAS ENTEROVARIEDADES DE Escherichia coli PATÓGENAS Autora: Andrea Zambrano Cobos Directora: BSc. Karina Ponce Codirector: Dr. Marcelo Grijalva Sangolquí - Ecuador 2012

2 INTRODUCCIÓN MATERIALES Y MÉTODOS RESULTADOS Y DISCUSIÓN CONCLUSIONES RECOMENDACIONES BIBLIOGRAFÍA TABLA DE CONTENIDOS

3 Escherichia coli (Enterobacteriaceae) CARACTERÍSTICAS: Anaerobio facultativo, Gram - Pared celular rígida y porosa Flagelos y pilis Membrana celular (lípidos y proteínas) Una sola cadena circular de ADN Aproximadamente 5000 genes Aislamiento e identificación BioquímicaSerotipificación

4 1.EPEC 2.ETEC 3.EIEC 4.EHEC 5.EAEC 6.DAEC CATEGORIAS DIARREOGÉNICAS Poseer distintos factores de virulencia Causar un síndrome diarreico diferente Presentar distinta epidemiología Pertenecer a distintos serotipos O:H Métodos específicos de detección

5 MECANISMO DE PATOGENICIDAD Variable depende E. coli diarreicas Invasividad. Adherencia a la superficie de la mucosa. Producción de enterotoxinas. Producción de citotoxinas

6 ETAs EHEC: La distribución es universal. Los alimentos asociados a brotes son el arroz, carne contaminada, salsa de vainilla. ETEC: Diarrea del viajero. Países en desarrollo. La transmisión ocurre por la ingesta de alimentos o agua contaminados. EIEC: Genéticamente igual a Shigella spp. Presentan colitis inflamatoria y disentería. EPEC: En niños menores de 2 años. Elevadas tasas de morbilidad y mortalidad. Trasmisión por contaminación fecal EAEC: La causa más frecuente de diarrea persistente en lactantes DAEC: Predomina en pre-escolares, niños pequeños y lactantes

7 VIGILANCIA EPIDEMIOLÓGICA Países desarrollados y subdesarrollados Datos epidemiológicos No existen reporte de E. coli patógenas

8 DETECCIÓN 1.Propiedades bioquímicas 2.Serotipo (Ciertas variedades) 3.Reacciones inmunoenzimáticas 4.Cultivos celulares 5. PCR 6. Hibridación de sondas Para estudios epidemiológicos PFGE, MLST

9 PCR MÚLTIPLEX Simple identificación 2 ó más loci en la Rxn Amplifica Diagnóstico rápido Alta confiabilidad Sensible y específico Esta correlacionado con la presencia de genes involucrados con la patogenicidad

10 Objetivo General Implementar un ensayo PCR múltiplex para la identificación de las enterovariedades de Escherichia coli patógenas OBJETIVOS DE LA INVESTIGACIÓN

11 Optimizar el sistema según los parámetros: Temperatura de hibridación, concentración de primers, tiempo y ciclos de amplificación Identificar los genes eltB y estA de E.coli enterotoxigénica, los genes vt1, vt2 y eaeA de E.coli enterohemorrágica, el gen ipaH de E.coli enteroinvasiva, el gen eaeA de E.coli enteropátogena, el gen aggR de E.coli enteroagregativa, el gen DA de E.coli difusa adherente Determinar la sensibilidad analítica del sistema. Elaborar un protocolo de implementación del ensayo PCR multiplex para la identificación de las enterovariedades Escherichia coli patógenas. Objetivos específicos

12 MATERIALES Y MÉTODOS DISEÑO DE TIPO EXPLORATORIO - CONFIRMATORIO Optimización: [primers], Tº Hibridación, Ciclos y tiempo de amplificación. Diseño PCR Multiplex Sensibilidad Especificidad

13 Controles positivos y primers Instituto de Ciencias Biomédicas de la Universidad de Chile y Dr. James Nataro de la Universidad de Virginia Cebadores DAECEPEC EHECEIECEAECETEC eltBestA eae vt1vt2 ipaH aggR Da 322 pb 147 pb 376 pb 130 pb 298 pb 600 pb 254 pb 750 pb

14 Extracción ADN genómico Kit comercial de Promega Wizard Genomic DNA Purification Temperatura de hibridación Rango: 56ºC-68ºC OPTIMIZACIÓN

15 Concentración de Primers 0,2 uM - 0,4 uM - 0,5 uM - 0,75 uM - 1uM DISEÑO DE PCR MULTIPLEX 1. Ensayo PCR: 8 pares primers en una Rxn 2. Ensayo PCR: Combinación de 2 pares de primers con cada DEC 3. Ensayo PCR: 2 PCR multiplex A y B Tiempos de amplificación 1 min-45 seg- 30 seg

16 LÍMITE DE DETECCIÓN Cepas de referencia : EHEC y ETEC ESPECIFICIDAD Escherichia coli Escherichia coli ATCC Escherichia coli ATCC Klebsiella pneumoniae Salmonella serotipo Enteritidis Vibrio cholerae

17 RESULTADOS Y DISCUSIÓN Microbiología

18 ADN Genómico ETEC: 33,6ng/uL EPEC: 20,2 ng/uL EIEC: 17,8 ng/uL EHEC: 17,3 ng/uL EAEC: 47,5 ng/uL DAEC: 10,8 ng/uL

19 Temperatura de hibridación M ipaH ipaH ipaH ipaH eae eae eae eae M eltB eltB eltB eltB aggR aggR aggR aggR EIEC-EPEC ETEC-EAEC

20 EIEC-ECDA M ipaH ipaH ipaH ipaH Da Da Da Da M vt2 vt2 vt2 vt2 vt2 vt2 vt2 c- EHEC

21 Concentración de cebadores 0,4 uM 0,2 uM vt1eae eltB aggRDa vt1 eae eltB estA Da Da Da

22 Diseño PCR multiplex Pool DNA

23 Primer Ensayo

24 Concentración de primers

25 Segundo Ensayo PCR Dúplex

26 Tercer Ensayo

27 MULTIPLEX A Y B A: EHEC-EPEC-DAEC B: ETEC-EIEC-EAEC B A Tercer Ensayo

28 MULTIPLEX A Y B

29 Limite de detección Multiplex A : EHEC Multiplex B : ETEC 0,0029 ng/uL 0,011 ng/uL

30 ESPECIFICIDAD M ETEC Salm Vibrio K.pneu C- Amplifica E. coli patógenas!!!

31 Prueba de Campo M m1 m2 C1+ C1- m1 m2 C2+ C2- Múltiplex A Múltiplex B EPECETEC

32 Conclusiones Se logro detectar los 8 genes virulentos de la E. coli diarreicas en dos PCR multiplex Los parámetros que fueron optimizados en la PCR monoplex variaron al momento de diseñar la PCR multiplex. Las [primers] oscilan entre 0,1 uM a 1,25 uM, la Tº de hibridación optimizada fue de 57ºC, el tiempo de los pasos de la PCR fueron de 45. Se dividió en 2 PCR multiplex: A identifica ECEH, ECEP, y ECDA. B identifica a ECET, ECEI, ECEA. La sensibilidad PCR multiplex A fue de 0,0029 ng/uL y B fue de 0,011 ng/uL. La especificidad del sistema se evaluó en otros microorganismos, resultando negativo la amplificación

33 Recomendaciones Realizar la técnica directamente desde las muestras de heces o desde la bacteria, aislando el ADN mediante kits comerciales. Antes de diseñar la PCR multiplex optimizar la temperatura de hibridación de cada cebador y la concentraciones de los mismos. Usar la PCR múltiplex para investigar un número elevado de microorganismos. Hacer uso de esta técnica para estudios a mayor escala como es la prevalencia de las diferentes enterovariedades de E. coli, caracterización genotípica, etc.

34 AGRADECIMIENTOS


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