Sonda mediadora de PCR: un nuevo enfoque para la detección de PCR en tiempo real basado en sondas primarias sin etiquetas y en indicadores fluorogénicos.

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1 Sonda mediadora de PCR: un nuevo enfoque para la detección de PCR en tiempo real basado en sondas primarias sin etiquetas y en indicadores fluorogénicos universales secundarios estandarizados B. Faltin, S. Wadle, G. Roth, R. Zengerle y F. von Stetten Noviembre de 2012 © Copyright 2012 by the American Association for Clinical Chemistry

2 Figura 1. Representación esquemática del principio de PCR.
Desnaturalización del ADN objetivo Hibridación de los cebadores Elongación de los cebadores Resumen Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en diagnósticos clínicos Multiplicación de ADN Varias aplicaciones, p. ej.: Genotipo (p. ej., polimorfismos de nucleótido único) Cuantificación (p. ej., carga de patógenos) Perfiles de expresión (p. ej., detección del cáncer)

3 Resumen (continuación)
Elongación del cebador y escisión de la sonda de hidrólisis Figura 2. Sonda de hidrólisis: estructura (arriba) y escisión durante la elongación del cebador (abajo). Hibridación de cebadores y sondas de hidrólisis Resumen (continuación) PCR en tiempo real (p. ej., sonda de hidrólisis de PCR) Ventajas Especificidad, sensibilidad Poco tiempo para la obtención de resultados Análisis multiplex Desventajas Alto costo (sonda individual para cada objetivo) Señal de fondo desigual en las diferentes sondas

4 Pregunta ¿Por qué la sonda de hidrólisis de PCR tiene un alto costo durante el desarrollo del ensayo o cuando se aplica a numerosos objetivos diferentes?

5 Métodos Sonda mediadora de PCR
Nuevo enfoque para multiplicación en tiempo real Sonda mediadora (MP) Región de 3’ específica según objetivo (sonda) Región genérica de 5’ (mediador) Sin etiqueta Indicador universal (UR) Fluoróforo y extintor Conformación de horquilla Sitio mediador de hibridación * * Figura 3. Estructura de la sonda mediadora (arriba) e indicador universal (abajo) * El extintor y el fluoróforo deben estar en estrecha proximidad

6 Métodos (continuación)
Figura 4. Sonda mediadora de PCR: (A) ADN objetivo, (B) Desnaturalización, (C) Hibridación de MP y cebadores, (D) Elongación del cebador; escisión de MP; liberación del mediador, (E) Hibridación del mediador al UR, (F) Elongación del mediador, (G) Degradación en el término de 5’ del UR. El extintor se libera del UR o (H) Desplazamiento en el término de 5’; desplegado de la horquilla y activación. Desnaturalización del ADN objetivo ADN objetivo Sonda mediadora Polimerasa Hibridación de cebadores y sonda mediadora Elongación del cebador y escisión de la sonda mediadora; liberación del mediador Degradación en el término de 5’ Desplazamiento en el término de 5’ Elongación del mediador Hibridación del mediador al indicador universal Cebador Mediador

7 Pregunta ¿Qué requisitos deben cumplirse para el diseño de secuencia de la sonda mediadora y el indicador universal?

8 Resultados Figura 5. Imprecisión intraensayo entre la MP de PCR y la sonda de hidrolisis de PCR. Los números de copias con cálculo regresivo de MP de PCR (abscisa) se trazan en comparación con los resultados de la sonda de hidrólisis de PCR (ordenada). Cálculo de 5 concentraciones de ADN diferentes con 8 reproducciones cada una.

9 Resultados (continuación)
Figura 6. Multiplicación dúplex de varias concentraciones de ADN de HPV18 y 300 copias de ACTB de H. sapiens. Los números de copias calculadas de HPV18 se trazan para la MP de PCR (abscisa) y la sonda de hidrólisis de PCR (ordenada).

10 Resultados (continuación)
Figura 7. Multiplicación de una serie de dilución de ADN de HPV18 (a) y E. coli (b). Los valores de la copias con cálculo regresivo para MP de PCR (abscisa) se trazan en comparación con los valores de la sonda de hidrólisis de PCR (HP) (ordenada).

11 Resultados (continuación)
Sonda de hidrólisis de PCR: 85 copias/rxn Sonda mediadora de PCR: 78 copias/rxn Figura 8. Límite de detección. MP de PCR (negro), Sonda de hidrólisis de PCR (gris). 95 %

12 Resultados (continuación)
Figura 9. Eficiencia de la extinción de la fluorescencia. Sondas de hidrólisis específicas (panel izquierdo) e indicadores universales (panel derecho).

13 Resultados (continuación)
Costos de la síntesis de oligos ($) Número de objetivos 1 4 10 Sonda de hidrólisis de PCR 245 980 2450 MP de PCR1 655 895 1500 UR 600 675 950 MP 55 220 550 1Costo de MP de PCR = Costo de UR + Costo de MP Tabla 1. Ahorro de costos para MP de PCR en comparación con la sonda de hidrólisis de PCR. Sobre el punto de equilibrio de 4 oligonucleótidos, la MP de PCR es más económica que la sonda de hidrólisis de PCR. Se calculan los costos de síntesis de oligonucleótidos para un número diferente de objetivos (escala de síntesis de 0.05 nmol).

14 Pregunta ¿Cuál es la ventaja de la MP de PCR en comparación con la sonda de hidrólisis de PCR?

15 Conclusión La MP de PCR es una técnica de PCR alternativa en tiempo real El límite de detección (LOD), la imprecisión entre ensayos e intraensayos y la capacidad doble de la MP de PCR son comparables con la sonda de hidrólisis de PCR Síntesis de bajo costo de MP específicas según objetivo y sin etiqueta Solo se requiere un indicador fluorogénico universal (UR) para controlar la multiplicación de diferentes muestras Ahorro de costos en la síntesis de UR gracias a la economía de escalas El UR tiene una alta eficiencia de enfriamiento independiente del objetivo

16 Gracias por participar en la edición de este mes del
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