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BIOTECNOLOGÍA INGENIERÍA GENÉTICA. Biotecnología : Conjunto de técnicas que utilizan las potencialidades de los organismos vivos o de compuestos procedentes.

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1 BIOTECNOLOGÍA INGENIERÍA GENÉTICA

2 Biotecnología : Conjunto de técnicas que utilizan las potencialidades de los organismos vivos o de compuestos procedentes de ellos (enzimas, hormonas, antibióticos ….), para la obtención de productos, bienes y servicios Biotecnología moderna: en los últimos 30 años, avances en microbiología, inmunología e ingeniería genética, con manipulación selectiva y programada de material genético Biotecnología contemporánea Clonación, nanotecnología, biomateriales, reprogramación Biotecnología tradicional: procesos de fermentación de bacterias y levaduras desde hace miles de años

3 Esto significa que desde hace miles de años, la humanidad ha venido realizando biotecnología, si bien hasta la época moderna, de un modo empírico, sin base científica La domesticación de plantas y animales ya comenzó en el período Neolítico. Las civilizaciones Sumeria y Babilónica (6000 años a.C.) ya conocían cómo elaborar cerveza. Los egipcios ya sabían fabricar pan a partir del trigo hacia el 4000 a.C. Antes de la escritura del libro del Génesis, se disfrutaba del vino en el Cercano Oriente: recuérdese que, según la Biblia, Noé "sufrió" (o disfrutó) accidentalmente los efectos de la fermentación espontánea del mosto de la uva (primera borrachera con vino). Otros procesos biotecnológicos conocidos de modo empírico desde la antigüedad: – fabricación de queso – cultivo de champiñones – alimentos y bebidas fermentadas: salsa de soja, yogur, etc. – tratamiento de aguas residuales

4 La biotecnología se practica para lograr una o más de tres metas: Entender más los procesos de la herencia y expresión genética. Proporcionar un avance en el conocimiento y tratamiento de diversas enfermedades, especialmente con enfermedades genéticas. Generar beneficios económicos, incluyendo la creación de plantas y animales mejorados para la agricultura y la producción eficaz de moléculas biológicas valiosas.

5 APLICACIONES DE LA BIOTECNOLOGÍA

6 ROJA - Aplicaciones médicas Obtención de nuevos productos y fármacos por organismos Producción de Ac monoclonales Desarrollo de terapias génicas y celulares VERDE – Aplicaciones agrícolas y ganaderas Desarrollo de cereales resistentes a plagas Desarrollo de animales resistentes a enfermedades Desarrollo de plantas que expresen pesticidas AZUL – Aplicaciones acuáticas y marinas Uso de plantas y productos marinos para obtener nuevos fármacos Restauración y preservación de especies acuáticas Uso de genes de organismos acuáticos para obtener resistencias BLANCA – Aplicaciones a procesos industriales Producción de nuevos compuestos Desarrollo de combustibles nuevos Uso de bacterias para eliminar vertidos de petróleo APLICACIONES DE LA BIOTECNOLOGÍA

7 Se descubrió posteriormente que esta práctica se venía haciendo en la naturaleza de forma espontánea desde hace millones de años en los vegetales a través de la bacteria llamada Agrobacterium tumefaciens. ORGANISMOS TRANSGÉNICOS Organismo transgénico: es aquél que ha sufrido la alteración de su material hereditario (genoma) por la introducción artificial (manipulación genética) de un gen exógeno, esto es, proveniente de otro organismo completamente diferente. Aparentemente no existen barreras para mezclar los genes (DNA) de dos especies diferentes. Existen bioherramientas moleculares para componer y descomponer al DNA, intercambiando así fragmentos específicos de ADN de distintas especies e incluso transferirlos a bacterias. Las bacterias producen hoy en día, proteínas humanas por ingeniería genética como el interferón, la insulina y la hormona del crecimiento, de gran importancia en la medicina.

8 Microorganismos transgénicos Producción de alimentos Eliminación de basuras Obtención de materias primas para la industria Descontaminar lo que las industrias han contaminado Animales de granja (cerdos, ovejas, borregos) "biorreactores de proteínas terapéuticas humanas en su leche (antitripsina, factor VIII de coagulación…) Plantas transgénicas "nueva revolución verde Resistentes a sequías, a herbicidas o a plagas de insectos, Maduración tardía o con características para mantener el color y sabor después de congelación Ejemplos : algodón, la soja, la papa, el tomate y al maíz ORGANISMOS TRANSGÉNICOS

9 La Ingeniería Genética Conjunto de técnicas, nacidas de la Biología molecular, que permiten manipular el genoma de un ser vivo, introduciendo genes en un organismo que carece de ellos Enzimas de restricción Capaces de cortar el ADN por puntos concretos ADN Recombinante Segmento de ADN extraño intercalado en un ADN receptor Se realiza por Se obtiene Técnicas biotecnológicas Recombinación de ADN Secuenciación del ADN Reacción en cadena de la polimerasa Aplicaciones diversas Incluye INGENIERÍA GENÉTICA

10 Técnicas de ADN recombinante: la manipulación genética Entre los años 70 y 80 se desarrollaron herramientas de la biología molecular y la ingeniería genética, lo que se conoce como técnicas del ADN recombinante La técnica se fundamenta en: Doble cadena del ADN Complementareidad de bases Siempre que se encuentren secuencias complementarias se unen Orden de las bases determina información de proteínas Código de transcripción universal

11 La tecnología del ADN recombinante incluye diferentes técnicas de las que destacan: La rotura específica del ADN mediante endonucleasas de restricción, que facilita el aislamiento y la manipulación de los genes individuales. La secuenciación rápida de todos los nucleótidos de un fragmento purificado de ADN, que posibilita determinar los límites de un gen y la secuencia de aminoácidos que codifica. La hibridación de los ácidos nucléicos que hace posible localizar secuencias determinadas de ADN o ARN, utilizando la capacidad que tienen estas moléculas de unirse a secuencias complementarias de otros ácidos nucléicos. La clonación del ADN, mediante la cual se puede conseguir que un fragmento de ADN se integre en un elemento génico autorreplicante (plásmido o virus) que habita en una bacteria, de tal manera que una molécula simple de ADN puede ser producida generando muchos miles de millones de copias idénticas. La ingeniería genética mediante la cual se pueden alterar secuencias de ADN produciendo versiones modificadas de los genes, los cuales se pueden insertar a células u organismos. Técnicas de ADN recombinante: la manipulación genética

12 Endonucleasas de Restricción: Enzimas que pueden cortar el ADN y lo hacen en secuencias concretas Enzimas que las bacterias usan para destruir ADN que ingresa a ellas, por ejemplo ADN de virus bacteriófagos Enzimas: Endonucleasas de restricción

13 Se conocen mas de 1200 enzimas de restricción Eco RI (E. coli) reconoce secuencias GAATTC y corta entre G y A

14 1 ADN plásmido 2 ADN extraño 3 Corte del plásmido y ADN extraño con Eco RI (endonucleasa de restricción) 4 Formación de extremos cohesivos 5 Formación de ADN recombinantes 6 Acción de ADN ligasa que sella los extremos Construcción de ADN recombinante

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16 Clonación del ADN La clonación de un gen consiste en introducirlo en una célula de modo que se copie y se mantenga El gen se inserta en un ADN llamado vector de clonación (plásmidos), capaz de entrar y replicarse de forma independiente en una célula huésped Resultado: ADN recombinante. Permite obtener grandes cantidades del gen insertado en la célula hospedadora adecuada apropiada Las genotecas de ADN permiten guardar indefinidamente el ADN de un organismo Un plásmido recombinante en una bacteria se replica con ella pudiendo obtenerse y aislarse millones de copias de dicho plásmido

17 Clonación del ADN 1. Obtención de plásmido recombinante 2. Transformación de bacterias 3. Selección de bacterias transformadas 4. Crecimiento de bacterias transformadas 5. Aislamiento de los plásmidos recombinantes Proceso de clonación de un gen en bacterias

18 Clonación del ADN Ejercicios: /unidades/ejercicios/act8abiointema6.htm Prácticas de ejercicios similares en la página indicada

19 Reacción en cadena de la polimerasa (Polymerase Chain Reaction) La reacción en cadena de la polimerasa (PCR), es una técnica que permite amplificar entre cientos de miles y millones de veces, en el transcurrir de pocas horas e in vitro, pequeñas cantidades de ADN. Es un método alternativo a la clonación muy rápido y eficaz Por su alta sensibilidad, esta técnica permite identificar un gen a partir de un solo cabello, una célula somática o un espermatozoide. Ha facilitado, y en muchos casos hecho posible, la tarea de identificación de personas, por ejemplo de hijos de desaparecidos, mediante el análisis de muestras del niño y de su abuela materna Aplicaciones médicas de la PCR en nuevas estrategias de diagnóstico: Detectar agentes infecciosos como los virus de las hepatitis B y C Regiones del genoma del virus de la inmunodeficiencia humana (HIV) Diagnosticar la presencia o ausencia de HIV en recién nacidos de madres seropositivas. Diagnóstico de hemofilias A y B, la distrofia muscular y la fibrosis quística, o reconocer mutaciones de genes vinculadas con enfermedades oncológ icas

20 El método se basa, en la realización de tres reacciones sucesivas llevadas a cabo a distintas temperaturas. Estas reacciones se repiten cíclicamente entre veinte y cuarenta veces Primer paso: La muestra se calienta hasta lograr la separación de las dos cadenas que constituyen el ADN, "desnaturalización". Segundo paso: la temperatura se reduce para permitir el "apareamiento" de cada una de dos cadenas cortas de oligonucleótidos (inicidores o primers) con cada una de las hebras separadas del ADN molde. Los primers son sintetizados en el laboratorio y diseñados de manera tal que permiten definir los límites del tramo de ADN que se desea replicar Tercer paso: la ADN polimerasa produce la extensión de los primers, en el espacio comprendido entre ambos, sintetizando las secuencias complementarias de las hebras del ADN molde (la Tª la condiciona la polimerasa Reacción en cadena de la polimerasa (Polymerase Chain Reaction)

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22 ADN polimerasa de E. coli se desactiva a la alta temperatura de la desnaturalización del ADN, por lo cual debía agregarse enzima fresca al comenzar el tercer paso de cada ciclo. Este inconveniente fue solucionado de manera ingeniosa cuando se la reemplazó por su equivalente de la bacteria "termófila" Thermus aquaticus kBo_pTOA8

23 Reacción en cadena de la polimerasa (Polymerase Chain Reaction) APLICACIÓN: amplificar ADN Fragmentos de ADN antiguos (momias, fósiles..) ADN de la escena de un crimen ADN de células embrionarias para diagnóstico prenatal ADN de genes virales

24 SECUENCIACIÓN DEL ADN: Método Sanger Métodos y técnicas para determinar el orden de los nucleótidos de un determinado fragmento de ADN Utilidad importante en biología básica y aplicada (forense…) Precisa gran cantidad del fragmento a determinar (clonación) Método Sanger o didesoxi: Fragmento de ADN (cantidad) Cebador en el extremo 3´ (20 bases) ADN polimerasa Desoxiribonucleótidos (A,T,C,G) Didesoxiribonucleótidos marcados radiactivamente (paran la síntesis) Cuatro tubos diferentes con: Polimerasa dATP, dCTP, dTTP y dGTP Un solo didesoxi marcado (ddATP) Se forman fragmentos de distinto tamaño terminados en A

25 SECUENCIACIÓN DEL ADN Los fragmentos de ADN obtenidos se separan por tamaños con electroforesis Cada una de las cuatro muestras se insertan en un carril diferente del gel Terminada la electroforesis se ponen en contacto con una película fotográfica

26 SECUENCIACIÓN DEL ADN: Método Automático Marcaje de ddNTP con fluorescentes distintos puediendose leer al mismo tiempo losADNs de las cuatro mezclas Comparativa de los dos métodos

27 El plásmido Ti o T-ADN de Agrobacterium contiene genes (onc) que provocan una mayor producción de hormonas de crecimiento con la formación del tumor o agalla. Se eliminan de Ti los genes onc y se sustituyen por otros genes que interese clonar, se habrá obtenido un sistema eficaz para introducir ADN interesante a la planta, evitando la aparición de la enfermedad INGENIERÍA GENÉTICA: Agricultura y medio ambiente Tradicionalmente se han mejorado los cultivos por selección de ejemplares Actualmente se mejoran características con técnicas de ADN recombinante: -Plantas transgénicas-

28 INGENIERÍA GENÉTICA: Agricultura y medio ambiente Actualmente se consiguen mejorar diferentes características con técnicas de ADN recombinante -Plantas transgénicas- FASES: 1. Transferencia de genes 2. Regeneración de plantas completas Resistencia a herbicidas (mejora vegetal) Resistencia al glifosfato herbicida no selectivo, con gen de E. coli resistente, clonado e incorporado Resistencia a plagas, con toxina de Bacillus turingiensis Resistencia a virus, con proteínas de la cápsida de dicho virus

29 Plantas farmaceúticas (biofarmaceútica) Producción de proteínas humanas, vacunas, anticuerpos, mas económicas y contienen mecanismos de modificación postraduccional de las proteínas, a diferencia de las bacterias Mejora del producto (alimentos) Arroz transgénico –arroz dorado- con βcaroteno (vit A) INGENIERÍA GENÉTICA: Agricultura y medio ambiente

30 Medio Ambiente: Utilización de organismos genéticamente modificados para eliminar contaminantes INGENIERÍA GENÉTICA: Agricultura y medio ambiente Biorremedación: bacterias modificadas para degradar hidrocarburos Bioadsorción: Bacterias modificadas que adsorben en su superficie metales pesados

31 Fitorremedación: Plantas transgénicas que transforman contaminantes peligrosos en sustancias inocuas INGENIERÍA GENÉTICA: Agricultura y medio ambiente chopos modificados para acumular metales, actualmente en condiciones controladas en invernadero La fitoestabilización :plantas que inmovilizan los metales en el suelo por absorción o adsorción en las raíces. Los contaminantes permanecen retenidos bajo la superficie del suelo La fitoextracción : plantas tolerantes capaces de absorber los metales desde el suelo y acumularlos en su biomasa aérea. Posteriormente, esta biomasa es cosechada, incinerada y tratada como residuo peligroso

32 INGENIERÍA GENÉTICA y GANADERÍA Inserción de genes en óvulos o células madre embrionarias: Quimeras transgénicas sólo sobre algunas células del embrión Organismos transgénicos todas las células modificadas Células modificadasCélulas no modificadasTransmisión a la descendencia, órganos y tejidos para trasplantes 1.Secuencia hibrida de gen de interés y secuencia promotora de una proteína de la leche 2. Introducir el transgén en óvulo fecundado 3.Implantación en la hembra que lo expresará junto con la leche Ejs.: α1-antitripsina, factor VIII,…

33 INGENIERÍA GENÉTICA y MEDICINA APLICACIONES Obtención de productos farmacéuticos Medicina forense Diagnóstico de enfermedades Terapia génica Insulina Interferón H. De crecimiento Factor VIII Marcadores genéticos Huella genética Detección en personas o fetos enfermedades hereditarias por técnicas de ADN recombinante Inserción de genes funcionales para corregir un defecto genético En células somáticas En células germinales

34 La forma activa de la insulina consta de dos polipéptidos (A y B), que están codificados por partes separadas de un mismo gen. Estos se pueden obtener en cultivos bacterianos separados. Promotor Subunidad B del gen de la insulina Subunidad A del gen de la insulina Extracción de las proteínas de fusión Separación de los polipéptidos A y B Formación de insulina activa Proteína de fusión con subunidad B del gen de la insulina Transformación en E. coli Proteína de fusión con subunidad A del gen de la insulina Producción de insulina humana

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36 CONSTRUCCIÓN DE ADN RECOMBINANTE

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