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Sistemas de Expresión Génica. Objetivo Conocer el diseño de una estrategia para expresión de proteínas Conocer los sistemas de expresión génica en bacterias,

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Presentación del tema: "Sistemas de Expresión Génica. Objetivo Conocer el diseño de una estrategia para expresión de proteínas Conocer los sistemas de expresión génica en bacterias,"— Transcripción de la presentación:

1 Sistemas de Expresión Génica

2 Objetivo Conocer el diseño de una estrategia para expresión de proteínas Conocer los sistemas de expresión génica en bacterias, levaduras e insectos.

3 Diseño de una estrategia para expresión de proteínas Elección del vector Aplicación u objetivos experimentales con la proteína expresada Información conocida de la proteína. Selección de la estrategia de clonado: solubilidad/localización subcelular/fusión a tags/regulación de la expresión. Preparación del vector corte con ER/desfosforilación/purificación Preparación del inserto de DNA plásmido y/o PCR/corte con ER/purificación Clonado del inserto dentro del vector Ligación/transformación en huesped/identificación. De clones positivos/verificación del producto clonado por secuenciación. Transformación dentro del huesped para expresión. Inducción y optimización de la expresión de la proteina de interés análisis cuantitativos de niveles de expresión y actividad biológica. Scale-up Purificaión de la proteína y análisis funcional

4 Sistemas de expresión de proteínas SistemaVel de crecimiento/ Costo Nivel de expresión Modificaciones post- traduccionales E. coli30 min. Bajo AltoNO Levaduras90 min Bajo Medio glicosilación Alta manosa Células insectos18-24 hs. Alto Medio glicosilación (largo, contenido manosa) Células mamíferos24 hs Alto BajoSi

5 Sistema de expresión en bacterias

6 Manipulación de la expresión génica en bacterias El objetivo principal de la ingeniería genética con fines industriales es lograr la correcta expresión a altos niveles del gen clonado en el microorganismo huésped elegido. Sin embargo, la clonación directa (sin manipulación adicional) de un gen en un vector normal (ej. como el pBR322) no suele asegurar que nuestro gen de interés se vaya a expresar bien, sobre todo cuando procede de especies alejadas filogenéticamente. Por esta razón hay que proceder al diseño de vectores especializados y a menudo a modificaciones del gen de interés, con objeto de que este pueda transcribirse y traducirse bien en el microorganismo huésped.

7 Elementos a considerar para determinar el sistema de expresión adecuado Naturaleza de las secuencias de inicio y final de la transcripción (promotores-operadores, terminadores) Señales para el comienzo de la traducción Eficiencia de la traducción Estabilidad de la proteína en la célula huésped Localización celular de la proteína a expresar Número de copias del gen clonado.

8 Lo que debe tener un vector de expresión en E. coli Un promotor eficiente, dotado de las regiones conservadas –35 (TTGACA o parecida) y –10 (TATAAT o parecida) A corta distancia del promotor, una región que al transcribirse suministre el sitio de entrada al ribosoma: la denominada secuencia de Shine-Dalgarno, que es complementaria del extremo 3 del ARNr 16S A unos 3-11 pb aguas abajo (dowstream) de la secuencia de Shine- Dalgarno, debería situarse el codón ATG que señala el comienzo de la traducción del ARNm. Este codón lo puede suministrar el gen a clonar, o bien el vector puede disponer de ese codón, seguido de alguna diana que permita la inserción del gen a expresar Finalmente, y situado al lado 3 de todo lo anterior, una secuencia que funcione como terminador de la transcripción (que en su forma de ARN constituye la típica horquilla por emparejamiento, donde la ARN polimerasa se desliga del ARN recién formado).

9 Ejemplos de promotores regulables en E. coli –Derivados del promotor lac –Derivados del promotor trp –Promotor híbrido artificial tac –Promotores derivados del fago –Promotor del fago T7

10 Promotores fuertes y regulables Expresar un gen a alto nivel, no siempre deberíamos escoger un promotor fuerte y constitutivo. Sin embargo, la mayor parte de las veces no conviene usar tal tipo de promotores, porque al estar expresando permanentemente el gen de interés a alto nivel, pueden sustraerse recursos para el normal crecimiento de las células. Esto es especialmente delicado si la proteína foránea tiene efectos negativos para el huésped. Por lo tanto, lo normal es emplear promotores regulables, que el investigador puede conectar y desconectar a voluntad. Una estrategia habitual es aquella en la que se cultiva la bacteria recombinante hasta que se logran grandes densidades, momento en que se suministra la señal para que el promotor se active y transcriba el gen insertado.

11 Elección del sistema de expresión en E. coli 1)Tamaño de la proteína: < 100 aminoácidos: estables como proteínas de fusión. >100 aminoácidos: inestables van a cuerpos de inclusión. Cuerpos de inclusión: agregados insolubles intracelulares. Ruptura células (sonicación)--- solubilización y refolding (Urea 8 M)---Diálisis 2) Cantidad de proteína: - Poca cantidad (screening de mutantes): plásmidos de expresión standard - Grandes cantidades: Explorar varios sistemas-huésped y esquemas de purificación. 3) Proteínas activas: considerar la formación de cuerpos de inclusión.

12 Proteínas expresadas en E. coli 1) Proteínas de fusión: Región que codifica una proteína tag fusionada en marco de lectura a la región que codifica para la proteína target. Cuando se transcribe y traduce genera una proteína de fusión purificación protege de proteólisis a la proteína de interés mejora la solubilidad de la proteína estabiliza a la proteína de interés ori Amp r ATGABMCS Promotor A Secuencia tag: *Dominio con función enzimática *Señales topogénicas B Secuencias consenso para Corte con una proteasa MCS Sitio múltiple de clonado Esquema genérico del vector

13 Fusion partnergene of interest MET... LEU ARG THR MET VAL ILE... End ATG... GTG CGA ACC ATG GTG ATC... TAG Nco I Note: translation stop of fusion partner gene must be removed Note: reading frame of fusion protein must be contiguous Construcción de una proteína de fusión Secuencias consenso para el corte con una proteasa –Clivan una secuencia corta y definida de aa –La secuencia de clivado para la proteasa está entre el gen carrier y el gen de interés fusion partnergene of interest protease cleavage sequence

14 Esquema general purificación de proteínas de fusión:GST Glutation Corte con proteasa GSTProteína Elution

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16 Optimización de la expresión de proteínas en E. coli 1)Iniciación de la traducción: Promotor fuerte producirá altos niveles de mRNA Se requiere optimizar la traducción. UAAGGAGG AUUCCUCC AUG53 mRNA S rRNA small ribosomal subunit Secuencia de Shine Dalgarno: Secuencia complementaria a región en 16S rRNA (subunidad pequeña del ribosoma) Secuencia 6-8 nt a -10 nt del AUG

17 2) Uso de codones: El código genético es redundante, usa 61 codones para 20 aa. Los codones (excepto Met y Trp con 1 codón c/u) que codifican para un aa no son usados con igual frecuencia. Algunos codones usados infrecuentemente=[RNA t ] CodonAminoácidoFrec. uso en E. coli Frec. uso en humanos GAGGlutámico0,30,59 GAAGlutámico0,70,41 CCGProlina0,550,11 CCAProlina0,200,27 CCUProlina0,160,29 CCCProlina0,100,33 Cepa Rosetta TM : cepa diseñada para aumentar la expresión de proteínas eucariotas que poseen codones de baja frecuencia en E.coli.

18 3) Estructura del mRNA: Región del codón de iniciación AUG en extremo 5 del mRNA no debe ser complementaria a sí misma, podría bloquear el movimiento del ribosoma y evitar la traducción 4) Cepas deficientes en proteasas: Lon y OmpT

19 Elección del promotor Promotores basados en el operón Lac: 1) Promotor Lac

20 Lac promoter pGEM®-3Z Vector sequence reference points. T7 RNA polymerase transcription initiation site 1; multiple cloning region 5-61 SP6 RNA polymerase promoter (.17 to +3) 67-86; SP6 RNA polymerase transcription initiation site 69 lac operon sequences ; binding site of pUC/M13 Reverse Sequencing Primer lacZ start codon 108; lacZ operator β-lactamase (Ampr) coding region binding site of pUC/M13 Forward Sequencing Primer T7 RNA polymerase promoter (-17 to +3) Cepa huesped: lacZ M15. Expresa LacI q

21 2) Promotores tac y trc: 3x más fuertes que trp y 10x más fuertes que lac Híbrido de promotores lac y trp Regulado por el represor lac Independiente de la regulación por cAMP XXXXXXXXXXXXXXXXXX -35 promotor trp-10 promotor lac Separación 16 pb=promotor tac 17 pb=promotor trc Gen de interés

22 Ptac promoter MalE: secuencia señal de la proteína Maltosa Binding Protein (MBP), periplásmica con alta afinidad por maltosa. Promotor Ptac/IPTG: Polylinker: : terminador de la transcripción

23 3) Promotores basados en el gen 10 del bacteriófago T7: Todos los promotores del fago T7 (incluído el gen 10) requieren la T7 RNA Polimerasa para expresarse lac proT7 RNA Pol g10 pro gene of interest Protein of Interest Inducer T7 RNA Pol El gen de la T7 RNA Pol puede estar bajo el control del promotor lac en genómico de E.coli El gen de interés puede estar bajo el control del promotor del gen 10

24 T7 promoter

25 pRSET Expression Vector The pRSET vector is designed for high-level prokaryotic expression controlled by the strong bacteriophage T7 promoter. Expression is induced by the production of T7 RNA polymerase in the BL21(DE3)pLysS host E. coli cells. These cells also produce T7 lysozyme to reduce basal expression of target genes. The pRSETvector offers: High-level expression from the bacteriophage T7 promoter T7 gene 10 sequence to provide protein stability N-terminal polyhistidine (6xHis) tag for rapid purification with ProBond® resin N-terminal Xpress® epitope for protein detection with the Anti-Xpress® Antibody Enterokinase cleavage site for removal of fusion tag f1 origin for ssDNA rescue to allow easy sequencing and mutagenesis

26 PL promoter- triptofano Mechanism of transcriptional regulation with pLEX POPO P trp cI repressor Bacterial Chromosome POPO PLPL ATG-GENE cI repressor No transcription Transcription pLEX vector No tryptophan POPO P trp cI repressor Bacterial Chromosome POPO PLPL ATG-GENE No transcription Transcription pLEX vector Tryptophan trp repressor 4) Promotores basados en el promotor del bacteriófago p L :

27 Problemas cuando se expresan proteínas eucarióticas en cél procariotas: Inestables. Sin actividad biológica. Contaminantes procarióticos. Soluciones: se han desarrollado sistemas de expresión en eucariotas Esp. importantes para proteínas terapéuticas. Necesidad de que tengan idénticas propiedades bioquímicas, biofísicas y funcionales a la proteína natural. Modificaciones post-traduccionales –Formación de uniones disulfuro correctas. –Clivaje proteolítico del precursor inactivo. –Glicosilación- agregado de residuos de azúcar –Alteración de aminoácidos en la proteína: fosforilación, acetilación, agregado de grupos sulfato, agregado de ácidos grasos

28 Producción de proteínas recombinantes en células eucariotas Problemas que suelen aparecer cuando proteínas eucarióticas se expresan en cél procariotas –inestables –sin actividad biológica –contaminantes procarióticos

29 Sistemas de expresión eucariotas Para eliminar los problemas de expresión en procariotas, se han desarrollado sistemas de expresión eucariotas –Esp. importantes para proteínas terapéuticas –Necesidad de que tengan idénticas propiedades a la proteína natural : bioquímicas biofísicas funcionales

30 Sistemas de expresión eucariotas Cuál es la diferencia? –Modificación post-traduccional de la mayoría de las proteínas eucariotas –Cél procariotas no pueden realizar estas modificaciones

31 Modificaciones post- traduccionales –Formación de uniones disulfuro correctas –Clivaje proteolítico del precursor inactivo –Glicosilación- agregado de residuos de azúcar –Alteración de aminoácidos en la proteína fosforilación acetilación agregado de grupos sulfato Agregado de ácidos grasos

32 Sistemas de expresión en levaduras

33 Sistemas de expresión en levaduras: ventajas –Organismo unicelular –Bien caracterizadas genética y fisiológicamente –Promotores fuertes disponibles –Plásmido natural (2µm) –Eucariotas, ocurren modificaciones post- transduccionales –Segregan algunas proteínas –No patógeno

34 Vectores de levaduras YIp: integrativos - una copia integrada a un cromosoma YEp: episomales - ori 2m (alto número de copias) YCp: centroméricos -ARS, CEN (1 o 2 copias por cél) Todos tienen marcador de auxotrofia y son shuttle

35 Vectores episomales –Son ampliamente usados –A menudo inestables en cultivos a gran escala (>10L) –Estrategia - alterar las condiciones de crecimiento para estabilizar el vector episomal usar cepas mutantes que requieren nutrientes específicos. –Leucina, Triptofano, Histidina el gen que provee el fenotipo salvaje se encuentra en el plásmido episomal

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37 Promotores de levaduras PromoterStatus Acid phosphatasePHO5Inducible Alcohol dehydrogenase IADH IConstitutive Alcohol dehydrogenase IIADH IIInducible GalctokinaseGAL 1Inducible MetallothioneinCup 1Inducible Phosphoglycerate kinasePGKConstitutive Triose Phosphate isomeraseTPIConstitutive

38 Sistemas de expresión en levaduras: desventajas –Inestabilidad de plásmidos en gran escala Vectores episomales –Superglicosilación de glicoproteínas 100+ residuos manosa vs normal puede alterar la actividad de la proteína –Proteínas secretadas quedan atrapadas en periplasma (entre la membrana y la pared celular) se usan señales peptídicas

39 Soluciones a los problemas en sistemas de expresión en levaduras Levaduras modificadas genéticamente para llevar a cabo glicosilación = humanos –Science Vol 301, p (29 Aug 2003) Deleción de genes de glicosilación de levaduras Agregado de genes de glicosilación humanos

40 Soluciones a los problemas en sistemas de expresión en levaduras Usar otro tipo de levaduras –Pichia pastoris –Hansenula polymorpha –No sólo Saccharomyces cerevisiae Usar otros eucariotas –Cél de insectos –Cultivos de cél de mamíferos

41 Levaduras como sistema de expresión Rápido crecimiento, bajo costo similar a E coli. Modificaciones postraduccionales escenciales para la función proteica. Problema (difieren de eucariotas superiores): forma de N-glicosilación y O- glicosilación: uso de levaduras con N-gycosilación humanizada. Saccharomyces cerevisiae Económico, bioseguro para aplicaciones humanos. Posee características bioquímicas, genéticas, similiar a eucariotas superiores. Es adaptable a fermentación gran escala. Herramienta para estudios de complementación. otros Pichia pastoris y Hansenula polymorpha.

42 Tipos de vectores YIp: integrativos: una copia integrada al cromosoma YEp: episomales: ori 2 (alto número de copias) YCp: centroméricos: ARS, CEN (1 o 2 copias por cél) Promotores Vectores de levaduras PromoterStatus Acid phosphatasePHO5Inducible Alcohol dehydrogenase IADH IConstitutive Alcohol dehydrogenase IIADH IIInducible GalctokinaseGAL 1Inducible MetallothioneinCup 1Inducible Phosphoglycerate kinasePGKConstitutive Triose Phosphate isomerase TPIConstitutive

43 Vectores episomalesVectores centroméricos

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45 Expresión de proteínas en Pichia pastoris 1)Requiere técnicas simples para la manipulación genética (similar a S. cerevisiae) 2)Producción de altos niveles de proteínas (intra y extracelular) 3)Modificaciones post-traduccionales: glicosilación, puente disulfuro, procesamiento proteolítico. 4)Kits de expresión disponibles. 5)Empleo del gen AOX1 Diagrama general de un vector P pastoris shuttle MCS Amp r, ori E : mantenimiento en E. coli AOX1p: promotor de alcohol oxidasa. AOX1t: secuencias terminador transcripción. MCS: sitio múltiple clonado. HIS4: marcador biosintético. 3´-AOX1

46 Integración del vector de P. pastoris Se integran para maximizar la estabilidad del sistema de expresión. Corte del vector que lleva inserto de interés flanqueado por secuencias del gen AOX1 (para recombinación homóloga requiere regiones terminales mas largas que S cerevisiae.) Transformación con vector linealizado por electroporación o métodos químicos. Cepa huésped: his4 pep4 prb1 (auxotrófica para Histidina y deficiente en proteasas). Inserto Selección en medio his - Cepa resultante aox1=Mut s Metanol: crec lento, alta producción prot.

47 Pichia methanolica Expression System Expresión controlada por promotor AUG1 (alcohol oxidasa): reprimido por glicerol o glucosa Inducido por metanol -factor: péptido señal para secreción de la proteína expresada. V5 epítope: para detección con anticuerpos anti-V5 6xHis: tag polihistidina purificación níquel-agarosa. ADE2: marcador biosintético.

48 Sistemas de expresión en insectos

49 Que son los baculovirus Los baculovirus son un grupo de virus encontrados mayormente en insectos (Baculoviridae). Tienen una estructura de varilla (baculum=bastón), un diámetro de entre nm y una longitud de entre nm. Su información genética está almacenada en una molécula de ADN doble cadena, circular, de aproximadamente Kpb.

50 Baculovirus como sistema de expresión

51 Características Ambiente eucariota para la producción de proteínas Expresión excepcionalmente alta Expresión durante la fase de oclusión Expresión a 27ºC Capacidad de grandes inserciones Expresión eficiente de genes no spliceados (cDNAs) Simplicidad de la tecnología

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53 Asignacion


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