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Procesamiento de Muestras Tóxicos que requieren pocos procesos de extracción. Ej: T. Volátiles Tóxicos que necesitan procesos de extracción, concentración.

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Presentación del tema: "Procesamiento de Muestras Tóxicos que requieren pocos procesos de extracción. Ej: T. Volátiles Tóxicos que necesitan procesos de extracción, concentración."— Transcripción de la presentación:

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3 Procesamiento de Muestras

4 Tóxicos que requieren pocos procesos de extracción. Ej: T. Volátiles Tóxicos que necesitan procesos de extracción, concentración y limpieza de extracto. Ej: T.O.F Tóxicos que requieren mineralización. Ej: Tox. Minerales

5 CONSIDERACIONES GENERALES Análisis orientado : Procedimientos de extracción y determinación especificas para una determinada sustancia. Cuando los antecedentes del caso apuntan hacia la misma o si se quieren hacer determinaciones cuantitativas. Análisis de drogas desconocidas: Esta modalidad implica la aplicación de un screening para descartar el mayor número de tóxicos posibles e incluir un número reducido de ellos, hasta lograr la identificación, pudiendo posteriormente aplicar una técnica directa para aumentar la posibilidad de identificarlas.

6 Orientativos en placa o tubo. Poco específicos pero muy sensibles ejemplo Reactivo de TRINDER para salicilatos o FPN para triciclicos De screening CCD. Permiten ir descartando y afinando la búsqueda. Gran sensibilidad poco especificidad. De confirmación, GCMS o HPLC De cuantificación GC-MS, GC-FID, HPLC; etc.

7 Preparación de la muestra: Este paso es crucial en los análisis. Generalmente involucra la homogeneización de las muestras, ajustes de pH, pesaje, procedimientos de hidrólisis (ácida, básica o enzimática), precipitación, centrifugación, etc. Aislamiento del analito: El método de aislamiento dependerá de la naturaleza del tóxico que se quiere aislar. Extracciones con sales y con solventes, o sea los métodos de salting out. Extracción en fase sólida (SPE), Etapas Etapas

8 Concentración del extracto: El objetivo de este paso es colocar el analito en el menor volumen posible y de esta manera aumentar la sensibilidad de los análisis. Identificación del analito: En la identificación del analito existen diferentes niveles de complejidad dependiendo de las técnicas que se utilicen para la detección de las mismas. nivel primario: que utiliza técnicas de separación e identificación como la cromatografía en capa delgada (TLC) y la espectrofotometría UV nivel secundario: (GC-MS, HPLC-MS).

9 Molienda y Liofilización: Para muestras sólidas como hígado o contenido gástrico. Trituración con Acido Tartárico y sulfato de Sodio Anhidro. Posterior Liofilización.

10 Hidrólisis Enzimática: Se le añade a la muestra 60ul de una mezcla de Glucuronidasa /Arilsulfatasa y 1ml de buffer fosfato de pH=6 y se encuba 14hs a 37 °C. Hidrólisis Alcalina: Se le añade a la muestra 1ml de NaOH 0,1M y se coloca 24hs a 60 °C. Posteriormente se lleva a pH=6 con buffer fosfato.

11 Se la añade 1ml de H 2 SO N y se encuba 12hs a 37°C. Posteriormente se lleva a pH=6 con buffer fosfato. Las columnas se activan con 2ml de metanol y 2ml de buffer fosfato de pH=6 lentamente y no dejando que se seque, se aplica la muestra, se lava la columna con 0,5ml de buffer fosfato y 1ml de una mezcla de buffer fosfato:metanol (80:20) y 1ml de ácido acético 1M. Se espera 2 min y se deja secar bien la columna, se centrifuga si es necesario. Se eluye con 1ml de una mezcla de Hexano:Acetato de Etilo (80:20) (con esta mezcla se eluye el THC). Posteriormente se eluye con una mezcla de diclorometano:isopropanol:amoníaco (80:20:2). (esta mezcla eluye drogas básicas).

12 Extracción Líquido-Líquido en ampollas Éter de petróleo para Plaguicidas Éter Etílico para Drogas de Carácter Ácido Cloroformo alcalino para D.C. Básico Extracción sólido-líquido: Columnas de Extrelut NT20, NT3 o bien SPE para HPLC, etc Tipos de Extracciones

13 Acondicionamiento de la columna Aplicación de la muestra. Lavado de la columna Ajuste de pH (si se lo requiere) Secado de la columna. Elución de la droga. Concentración del extracto.

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15 A T° ambiente y con corriente de N 2. Redisolver el extracto y proceder a limpieza según la extracción, neutra ácida o básica por columnas con fluorosil arena lavada, etc. o por diferentes densidades o por diferentes pH. Así se obtiene un extracto limpio

16 FRACCIÓN ETER DE PETRÓLEO ÁCIDO: Se agrega al extracto seco 5ml de alcohol al 30% v/v, se filtra en frío y sobre la solución se hace la investigación toxicológica. FRACCIÓN ETER ETÍLICO ÁCIDO: Agregar 10ml de agua destilada, calentar levemente para favorecer la disolución del residuo. Enfriar. Llevar a pH=3 con ácido sulfúrico al 1%. Extraer con 20ml de ciclohexano:cloroformo (25:75). Agitar durante 5min. Filtrar la mezcla orgánica en un embudo de papel de filtro conteniendo una pequeña cantidad de sulfato de sodio anhidro, para eliminar los vestigios de humedad. Evaporar y retomar en 1ml de metanol. FRACCIÓN ETER ETÍLICO ALCALINO y FRACCIÓN CLOROFORMO ALCALINO : Tomar el residuo con algunos mililitros de ácido sulfúrico 5%. Extraer con éter etílico. Desechar la fracción orgánica. Alcalinizar la fracción acuosa restante con amoniaco y extraer 3 veces con porciones de 10ml de éter etílico. Filtrar,evaporar y retomar con 1ml de metanol.

17 Inmunoensayos Los mas utilizados son el IEE (Inmuno Ensayo Enzimático), el RIE (Radio inmuno Ensayo), IEF (Inmuno Ensayo Fluorescente), y el IEA (Inmunoensayo por Aglutinación). Las reacciones de coloración directamente en la orina tienen un uso limitado, solo algunas drogas pueden ser ensayadas por ejemplo: salicilatos, hidrocarburos halogenados, paracetamol, etc. Ejemplo 2 gotas de orina+Cloruro férrico 5% (2 gotas) Violeta: posibles salicilatos

18 REACCIONES CROMÁTICAS - EXTRACTO FUERTEMENTE ÁCIDO: Tricloruro férrico Folin-Ciocalteu Liebermann Nessler Diazotación Koppanyi-Zwikker - NEUTRO: Koppanyi – Zwikker Liebermann Nessler - BÁSICO: P-Dimetilaminobenzaldehído Cloruro férrico Formaldehído – Sulfúrico Forrest FPN Mandelin Marquis

19 En el screening por TLC y HPTLC se utilizan placas de silicagel 60 GF- 254nm (con indicador de fluorescencia), y lo que varía son las fases móviles y los sistemas de revelado.

20 Placas Silicagel GF 254 Cloroformo:Acetona (8:2) 1) Uv 254 y 366nm. 2) Acetato de cobalto en metanol 0.5% 3) HgSO 4 (5g deHgO + 20ml de H 2 SO 4 ) 4) Trinder o Cl 3 Fe

21 Placas Silicagel GF 254 Metanol:Amoniaco (100:1,5) 1) UV 254 y 366nm 2) Rociado con HCl 10% 3) Observación UV 366nm (fluorescencia) 4) NQS 5) IodoplatInato 6) Draggendorf

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23 . Cuantificación del analito: Una vez identificado el analito la cuantificación del mismo se puede realizar por una técnica directa, bien ajustada y utilizando patrones de referencia puros para análisis. (GC-MS, HPLC-MS).

24 BIBLIOGRAFÍA -Caferata Nores La prueba en el proceso penal -Gisber Calabuig Tratado de medicina legal y toxicología -Tratado de criminalística, tomos I y II, La química analítica en la investigación del delito.


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