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DETERMINACION FLUORIMETRICADE QUININA EN TONICA Pablo Fernández López.

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DETERMINACION FLUORIMETRICADE QUININA EN TONICA Pablo Fernández López.

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1 DETERMINACION FLUORIMETRICADE QUININA EN TONICA Pablo Fernández López

2 ¿QUE ES LA FLUORESCENCIA?

3 FLUORESCENCIA: Absorción molecular de un fotón Emisión una luminiscencia a mayor Salto de Stokes Toma su nombre de la fluorita

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17 Extensión del sistema de electrones Rigidez estructural Impedimentos estéricos Efecto de átomo pesado interno Naturaleza de la transición Formación de complejos organometálicos Efectos de los sustituyentes FACTORES ESTRUCTURALES

18 Extensión del sistema de electrones Extensión del sistema de electrones

19 Rigidez estructural

20 Impedimentos estéricos cis 1,2-difenileteno trans 1,2-difenileteno

21 Efecto de átomo pesado interno FLUORESCENCIA RELATIVA 100% 7% 0.2% <0.05%

22 Absortividad molar alta Velocidad de fluorescencia elevada n Absortividad molar baja Velocidad de fluorescencia pequeña Naturaleza de la transición fluorescente

23 Formación de complejos organometálicos Cambio en la naturaleza de la transición n -Análisis de metales -Análisis de ligandos poco fluorescentes Favorecer el cruzamiento entre sistemas

24 Efectos de los sustityentes Los electrodonadores: -NH 2, -NHR, -NR 2, -OH, y -OR aumentan la eficacia de la fluorescencia,desplazándola a mayores Los electroaceptores: -COOH,-COOR, -CHO, -COR y –NO 2,reducen la eficacia de la fluorescencia al introducir una transición n- *. Los halógenos producen efecto de átomo pesado interno Los grupos sulfónicos no modifican significativamente la fluorescencia

25 FACTORES DEL MEDIO Temperatura Polaridad Viscosidad Atomo pesado externo pH Puentes de hidrógeno Otros solutos: atenuación de la fluorescencia

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37 Fluorescencia de la orina

38 Fluorescencia del suero sanguíneo

39 Fluorescencia de la leche de vaca

40 ANALISIS CUALITATIVO

41 IDENTIFICACION EN EL ESPECTRO DE LAS DIFERENTES BANDAS Y PICOS

42 Fluorescencia de la quinina excitación emisión Fluorescencia Longitud de onda (nm)

43 Fluorescencia de la quinina excitación emisión Fluorescencia Longitud de onda (nm)

44 Fluorescencia de la quinina excitación emisión Fluorescencia Longitud de onda (nm)

45 Fluorescencia de la quinina excitación emisión Fluorescencia Longitud de onda (nm)

46 Fluorescencia de la quinina excitación emisión Fluorescencia Longitud de onda (nm)

47 Fluorescencia de la quinina excitación emisión Fluorescencia Longitud de onda (nm)

48 Fluorescencia de la quinina excitación emisión Fluorescencia Longitud de onda (nm) Máximo de excitación Máximo de emisión

49 Fluorescencia de la quinina excitaciónemisión Fluorescencia Longitud de onda (nm) ¿Esto que es?

50 ESPECTRO DE EXCITACION SIN SELECCIONAR em. La dispersión ocurre a todas las longitudes de onda.

51 ESPECTRO DE EXCITACION A em = 450 nm Resulta un pico de luz dispersa proveniente de la lámpara a ex = em = 450 nm. Pico Rayleigh

52 ESPECTROS ANTERIORES SUPERPUESTOS

53 Pico Rayleigh ESPECTRO DE EXCITACION A em = 450 nm. RENDIJAS A 16 nmRENDIJAS A 2nm ANCHURA DEL RAYLEIGH SEGUN RENDIJA

54 ESPECTROS DE EXCITACION A DOS em RENDIJAS A 16 nmRENDIJAS A 2nm POSICION DEL RAYLEIGH RESPECTO AL ESPECTRO

55 COMPARACION DE ESPECTROS

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58 NORMALIZACION DE ESPECTROS

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60 ANALISIS CUANTITATIVO

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67 ex = 350, em = 450 nm

68 [Quinina] (ppb) Fluorescencia tónica3.77

69 PROCEDIMIENTO 1.- Preparar disoluciones de 100, 200, 300, 400 y 500 ppb a partir de una disolución de sulfato de quinina de 2.5 ppm y enrasar a 25 ml con H 2 SO N. 2.- Registrar los espectros de excitación y emisión de una de las muestras y medir la intensidad de fluorescencia a 350 nm de excitación y 450 nm de emisión de todas ellas para construir la recta de calibrado. 3.- Pasar el contenido de un agua tónica a un vaso de precipitado y agitar vigorosamente a temperatura ambiente durante 10 minutos. 4.- Tomar 1.0 ml y añadir la cantidad necesaria de H 2 SO 4 concentrado (36 N) para que en un volumen final de 250 ml sea 0.1 N. 5.- Registrar los espectros de excitación y emisión, comprobando que en estas condiciones la fluorescencia del agua tónica es debida únicamente a la quinina. 6.- Medir la fluorescencia a 350 nm de excitación y 450 nm de emisión calculando la concentración de quinina en el agua tónica a partir de la recta de calibrado. MATERIALESPRODUCTOS - Espectrofluorímetro - Matraces de 25 ml. - Pipetas graduadas. - Vaso precipitado. - Agitador magnético con núcleo. - Agua tónica - H 2 SO 4 - Bisulfato de quinina PRÁCTICA Nº 1 DETERMINACIÓN ESPECTROFLUORIMÉTRICA DE QUININA EN AGUA TÓNICA

70 1.Componentes principales de un espectrofluorímetro. Función principal de cada uno de ellos. 2. En los espectros que se han dado en la práctica se muestra el espectro de excitación y de emisión de fluorescencia de quinina. Comentarlos brevemente, es decir: a) Identificar cada uno de los espectros b) Localización de los máximos. Número de bandas que presenta cada espectro c) Señalar los máximos de intensidad. ¿Conviene realizar el calibrado a dichos máximos? ¿Por qué? d) Encontramos alguna simetría entre ambos espectros. ¿Por qué? e) En excitación encontramos más de una banda de fluorescencia. Si se pretende evitar interferencia en la medida por parte de otras sustancias que puedan estar presentes en la muestra, ¿Qué banda se debería elegir para la determinación de quinina en tónica? PREGUNTAS DE LA PRÁTICA PARA EL CUADERNO

71 3. En espectrofotometría, los espectros son de excitación mientras que en espectrofluorimetría estos son de emisión y de excitación, es decir tridimensionales. Ventajas e inconvenientes (al menos 3) 4. ¿Coincide un espectro de excitación de fluorescencia con uno de absorbancia (espectrofotometría)? ¿Por qué? Explicarlo en términos de transiciones electrónicas. 5. ¿Cómo se relaciona la señal instrumental que se mide en fluorescencia y en espectrofotometría respecto a la intensidad de la radiación incidente? ¿Es ésta monocromática o policrómática? Explique la respuesta 6. Dibuja un posible espectro de excitación de fluorescencia de la clorofila sabiendo que absorbe en las regiones visibles del azul y del amarillo. Dibuja igualmente su espectro de emisión fluorescente.

72 PREGUNTAS DE LA PRÁTICA PARA EL CUADERNO 7. Una muestra problema ofrece un espectro de absorbancia en el que se observan tres máximos claramente definidos ¿Qué puede deducirse al respecto? 8. La muestra anterior ofrece un espectro de emisión de fluorescencia en el que se observan dos máximos claramente definidos. ¿Qué puede deducir en este caso? Dibujar este espectro y su correspondiente de excitación de fluorescencia (téngase presente tanto los valores de longitud de onda como de intensidad). 9. Proponga una estrategia para detectar el pico de luz dispersa (pico Rayleigh) en un espectro de emisión de fluorescencia. 10. Resultados obtenidos: recta de calibrado y concentración de quinina en la tónica.

73 La quinina, C 20 H 24 N 2 O 2 es un alcaloide natural, blanco y cristalino, con propiedades antipiréticas, antimalaria y analgésicas. Fue el principal compuesto empleado en el tratamiento de la malaria ya que resulta tóxico para el plasmodium, el parásito que infecta los glóbulos rojos. Actualemente, ha sido sustituida por otros medicamentos sintéticos más eficaces. Se puede utilizar todavía en el tratamiento de la malaria resistente, los calambres nocturnos en las piernas y en la artritis. Sin embargo, su usoa dosis terapéuticas puede provocar cinchonismo; en dosis altas o casos raros, puede ser incluso letal, debido a un edema pulmonar agudo y fulminante. El dosis muy elevadas puede provocar aborto o defectos de nacimiento (especialmente sordera) si es tomada por mujeres durante el embarazo. La quinina se extrajo por primera vez de la corteza de la quina, un árbol presente naturalmente en Sudamérica. Fue aislada y bautizada así, en 1820, por los investigadores franceses Pelletier y Caventou. La quinina se usa como potenciador del sabor en el agua tónica, confiriéndole su característico sabor amargo. Debido a los efectos secundarios de altas dosis de quinina, su concentración se ha limitado por la FDA estadounidense a un máximo de 83 ppm. Este valor es aproximadamente un cuarto del empleado terapéuticamente. ¿QUE ES LA QUININA?

74 ESTRUCTURA MOLECULAR

75 Quinina Número CAS[ ] Fórmula químicaC 20 H 24 N 2 O 2 Peso molecular Propiedades físicas Punto de fusión177°C (descompone ligeramente) Punto de sublimación180°C (en alto vacío) Densidad1.293 g/cm 3 Solubilidad en agua 1 gramo/1900 mL, pH de la disolución saturada: 8,8, también soluble en etanol (1 g/0,8 mL), 4 g/l (éter anhidro), benceno (1 g/80 mL), cloroformo (1 g/1,2 mL), glicerol (50 g/L) FluorescenciaAzul, se intensifica en ácido sulfúrico

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