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Por: M. en C. de Educ. Guadalupe E. Daleth Guedea Fernández abril 2006 4ª y última parte.

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1 Por: M. en C. de Educ. Guadalupe E. Daleth Guedea Fernández abril ª y última parte

2 Distribución de la luz en el espectrofotómetro Curva Patrón Tipos de Espectrofotómetro Referencias e Imágenes

3 Distribución de la luz en el espectrofotómetro

4 Espectrofotómetro Mecanismo Interno

5

6

7 Met.Cient. I COLOR LONGITUD DE ONDA ( ) Rojo (R) 700 nm Verde (G) nm Azul (B) nm

8 ¿Porque leer a diferentes (longitudes de onda) compuestos parecidos pero diferentes? Es usual que al seguir una receta para la determinación de la concentración de un compuesto en particular se indica una longitud de onda ( específica a la que hay que leer con el colorímetro o espectrofotómetro. La explicación radica en el hecho de que cada producto químico se caracteriza por zonas del espectro visible o no visible en el cual absorbe con mayor o menor intensidad conformando en su conjunto el espectro de absorción de tal sustancia.

9 Cada compuesto (de complejo a simple) presenta un espectro de absorción característico Las longitudes de onda con mayor absorción (picos) corresponderán de forma general a aquellas con las que se leerá la muestra para determinar su concentración La relación entre la absorbancia por una sustancia a una determinada y su concentración es directamente proporcional es decir: a mayor concentración mayor proporción de luz absorbida. Absorbancia Conc. Absorbancia Absorbancia

10 Así, el espectro de absorción de la clorofila es:

11

12 Espectro de Absorción (línea continua) y Espectro de Transmisión (línea discontinua). Colorante común, la Rodamina 6G en Metanol..

13 celda de 5uL La muestra se coloca en una cubeta* de forma prismática

14 Se asume que el tubo, celda o cubeta en la cual se vierte la solución a leer no debe desviar la trayectoria de la luz como requisito para el cumplimiento de la ley de Beer

15 Como el cuarzo aparte de ser muy transparente muestra un comportamiento constante ante la variación de la longitud de onda, es usual que las celdas del espectrofotómetro o colorímetro sean de este material.

16 El argumento para el proceso de determinación de una concentración desconocida es: A partir de concentraciones conocidas de las cuales también se sabe su absorbancia (curva patrón), es posible interpolar (intercalar) la concentración del problema sabiendo su absorbancia (línea roja en figura siguiente) Curva Patrón

17 ABS0RBANCIA ABS0RBANCIA Interpolación Absorbancia del problema

18 Con base en que la Absorbancia guarda una relación lineal con la concentración, se comprende la existencia de una relación de proporcionalidad entre la Absorbancia y la concentración: A1 / A2 = C1 / C2 Donde: A1 = Absorbancia del problema. A2 = Absorbancia de un estándar de concentración conocida. C1 = Concentración del problema. C2 = Concentración del estándar. Si despejamos C1 = Conc del problema A1 (problema) * Conc estándar Conc. (problema) = A2 (estándar)

19 Ejemplo de curva patrón para la determinación de safranina; donde se solubiliza este colorante únicamente en agua siendo por tanto el agua misma el tubo blanco o de referencia para la calibración del equipo (colorímetro o espectrofotómetro)TUBO Stock de Safranina (3 x10 -4 g/ml) ml (3 x10 -4 g/ml) ml Agua Destilada ml

20 En este ejemplo de determinación de Glucosa, en la preparación de los tubos para la lectura de la curva patrón, se incluyen más elementos y por lo cual el tubo blanco (0) contiene todos los componentes excepto la glucosa con el fin de de poder calibrar la absorbancia del equipo a ceroCompuesto 1 (blanco) Glucosa 0,1 mg/ml (mL) Agua destilada (mL) Fenol al 5% (mL) Acido sulfúrico (mL)

21 Tubos Absorbanci a Absorbancia en el Espectrofotómetro a 490 nm RESULTADO de la curva patrón anterior

22 Un aspecto importante de la evaluación espectrofotométrica, es que muchas moléculas orgánicas no absorben en el intervalo del espectro visible sino en el rango de longitudes de onda acordes al ultravioleta o al infrarrojo Por lo que es común, actualmente, que la mayoría de los espectrofotómetros, actuales, se encuentren provistos con lo necesario para leer en de tales intervalos Así, los grupos carbonilo presentes en los aldehídos (RCHO), cetonas (RCOR), ácidos carboxílicos (RCOOH), l ésteres (RCOOR´) y amidas (RCONHR´) dan lugar a absorciones intensas en la región del espectro de infrarrojo situada entre cm-1.

23 Absorciones máximas (picos de absorción) de algunos compuestos que absorben en la región ultravioleta:

24 Grupos funcionales cuyos picos de absorción se localizan en la región del infrarojo

25 Tipos de Espectrofotómetro Existen en la actualidad diversos tipos de aparatos con los mismos principios los hay mecánicos y digitales; unos miden solo la luz visible, otros son más precisos y miden también luz U.V., Infrarroja, de absorción atómica (AA), flurescencia de rayos-X de emisión de plasma (ICP),, multipropósitos (para medir directamente la solución con suspensión, muestras sólidas y biológicas), acoplado a masas,etc..

26 Diferentes tipos de espectrofotómetros MCI Para medir Luz Visible Para medir Luz Visible y U.V.

27 Spectronic 20 D Spectrónic 20

28 Partes del Spectronic 20 D

29 Manejo de espectrofotómetro En las siguientes diapositivas se les proporciona el instructivo para el manejo el espectrofotómetro Modelo Spectronic 20.

30 Manejo de espectrofotómetro Prender el aparato ( a )10 minutos antes de utilizarse, se activará la luz roja de encendido ( b ). Prender el aparato ( a )10 minutos antes de utilizarse, se activará la luz roja de encendido ( b ). Seleccionar la longitud de onda con el botón ( c ). Seleccionar la longitud de onda con el botón ( c ). Ajuste (con a ) a 0% de transmitancia, con la tapa cerrada y sin muestra. Ajuste (con a ) a 0% de transmitancia, con la tapa cerrada y sin muestra. Insertar la cubeta con el blanco en su sección ( d ). Insertar la cubeta con el blanco en su sección ( d ). a b c d

31 Ajustar (con e) a 100% transmitancia (0 absorbancia) Ajustar (con e) a 100% transmitancia (0 absorbancia) Retirar el blanco de la cubeta, agregarle la muestra problema, e insertar en su espacio, bajar la tapa. Retirar el blanco de la cubeta, agregarle la muestra problema, e insertar en su espacio, bajar la tapa. La aguja (d) del lector se deslizará sobre la escala (f), se lee en % de transmitancia ó en unidades de absorbancia La aguja (d) del lector se deslizará sobre la escala (f), se lee en % de transmitancia ó en unidades de absorbancia e d f

32 CUIDADOS Las muestras no deben tener burbujas, encontrarse turbias o con precipitados. Las muestras no deben tener burbujas, encontrarse turbias o con precipitados. El volumen de la muestra en la cubeta, no debe ser excesivo para evitar que se desborde, en caso de que sucediera, se debe limpiar con un paño limpio o papel absorbente suave, para evitar rayarla. El volumen de la muestra en la cubeta, no debe ser excesivo para evitar que se desborde, en caso de que sucediera, se debe limpiar con un paño limpio o papel absorbente suave, para evitar rayarla. La cubeta se sujeta por los lados opacos. La cubeta se sujeta por los lados opacos. La cantidad a adicionar es, máximo, hasta ¾ partes de la cubeta La cantidad a adicionar es, máximo, hasta ¾ partes de la cubeta No se deben derramar líquidos, sobre todo solventes, ácidos o álcalis; dentro del contenedor de la cubeta, se puede dañar parte del mecanismo No se deben derramar líquidos, sobre todo solventes, ácidos o álcalis; dentro del contenedor de la cubeta, se puede dañar parte del mecanismo Se debe mantener, el espectrofotómetro, limpio y libre de humedad Se debe mantener, el espectrofotómetro, limpio y libre de humedad

33 Referencias e Imágenes de: ciencianet.com/ espectros.html Guiones/Practica1.htm omega.ilce.edu.mx:3000/sites/ ciencia/volumen3/ciencia3/112/htm/sec_17.htm elementos de espectroscopia. Leyes de los procesos de absorción de la radiación por: João Carlos de Andrade, Rogério Custodio, y Lauro T. Kubota, tr María Del Pilar Taboada Sotomayor Creado en: ABR/1999(Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Química) Última actualización: MAR/2000. revisado en marzo de João Carlos de AndradeRogério Custodioauro T. Kubota María Del Pilar Taboada Sotomayor pdf Introducción a la Espectroscopía de Absorción Molecular Ultravioleta, Visible e Infrarrojo Cercano Ing. Carlos Brunatti Lic. Ana María Martín consultado marzo pdf

34 /Cap05/05_01_01.htm obtenida el 1 Nov :44:24 GMT. Consultado enero /Cap05/05_01_01.htm Plummer, D.T Bioquímica práctica. Mc-Graw-Hill Latinoamericana. Bogota, Colombía Klett-Summerson.Photoelectri colorimeter. General Direction. Klett Manufacturing Co., Inc. New York La%20luz%20como%20ondas%20electromagn%E9ticas.htm Consultado en Diciembre de perso.wanadoo.es/ latinquasar/glosario2.html cap02/anexo_28.htm laser/Ch-6/C6s4p2.htm Productos/UV/UVmini.htm Consultado en enero de carbono.html consultado en abril de 2006http://html.rincondelvago.com/analisis-de-hidratos-de- carbono.html es.geocities.com/ qo_09_estructuras/

35 gemini.udistrital.edu.co/.../ cal03.htm Acton%20NCL.htmwww.palintestusa.com/images/photo5.jpgwww.roper.co.jp/Html/ stats/chi_fit.html gemini.udistrital.edu.co/.../ cal03.htm espectrofotometro.htm c/inve/tec2_2.htm Productos/UV/UVmini.htm http//www.carbus.galeon.com/pintura/colorimetria.htm PHYSIK/PH/PH3_D.htm photojournal.jpl.nasa.gov/ catalog/PIA06160

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37 * Basado en el trabajo de ppw : Arriaga F. Alberto y Guedea Fdz. Guadalupe., Fundamentos de colorimetría y espectrometría Julio de 2005, para Met. Científica 1 Biología, FES Iztacala UNAM. Sin publicar * Basado en el trabajo de ppw : Arriaga F. Alberto y Guedea Fdz. Guadalupe., Fundamentos de colorimetría y espectrometría Julio de 2005, para Met. Científica 1 Biología, FES Iztacala UNAM. Sin publicar ***Imagenes proporcionadas por Carlos S. Chinea ***Imagenes proporcionadas por Carlos S. Chinea Las imágenes señaladas con MCI fueron tomadas en el 2005 de los aparatos que se encuentran en el Laboratorio de Metodología Científica I de la Carrera de Biología en la Facultad de Estudios Superiores Iztacaca UNAM México. Las imágenes señaladas con MCI fueron tomadas en el 2005 de los aparatos que se encuentran en el Laboratorio de Metodología Científica I de la Carrera de Biología en la Facultad de Estudios Superiores Iztacaca UNAM México.

38 DATOS DEL AUTOR Mexicana, Bióloga (UNAM) y Maestra en Ciencias de la Educación (ETAC); Mexicana, Bióloga (UNAM) y Maestra en Ciencias de la Educación (ETAC); Correo: y/o Correo: y/o


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