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Introducción a la Microscopía de Fluorescencia Renzo Gavilanez Motic Instruments, Inc.

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Presentación del tema: "Introducción a la Microscopía de Fluorescencia Renzo Gavilanez Motic Instruments, Inc."— Transcripción de la presentación:

1 Introducción a la Microscopía de Fluorescencia Renzo Gavilanez Motic Instruments, Inc

2 Microscopía de Fluorescencia Contenido: Principio Aplicaciones –Para Ciencias de la Vida –Para Ciencias de Materiales Equipo necesario –Microscopio Fuentes de Luz Juego de Filtros Selección de filtros Lentes Objetivos

3 Fluorescencia Espectro de luz visible: La longitud de onda determina el color

4 Fluorescencia ¿Qué es? Es un proceso de interacción entre la radiación y la materia en el cual un material absorbe radiación de una fuente específica y muy rápidamente emite luz cuya energía es menor (de mayor longitud de onda) que la de la radiación que ha absorbido.

5 Fluorescencia Espectro de luz visible: Excitación Emisión

6 Fluorescencia ¿Cómo se produce? Los electrones son excitados a estados vibracionales y rotacionales más altos y cuando vuelven a su estado fundamental emiten la energía de excitación en forma de radiación.

7 Fluorescencia (definiciones) Debido a la disipación interna de energía la luz emitida tiene siempre una longitud de onda mayor (menor energía) que la luz de excitación. La cantidad de luz emitida es muy pequeña en comparación con la utilizada para la excitación. Los materiales que fluorescen lo hacen porque contienen estructuras con configuraciones moleculares particulares conocidas como fluoróforos o fluorocromos.

8 Fluorescencia (definiciones) Un fluorocromo es una molécula capaz de absorber fotones y emitir fotones de menor energía (mayor longitud de onda). Un fluoróforo es la parte del fluorocromo responsable de la emisión de la fluorescencia.

9 Fluorescencia (definiciones) Tipos de fluorescencia: La fluorescencia primaria es la que se da porque existe una configuración inherente a la estructura molecular. Algunas de las fluorescencias más intensas que se observan se asocian con moléculas aromáticas, la fluorescencia de materiales inorgánicos se observa en muchos minerales y piedras preciosas, y quelatos específicos: Clorofila, aceite de inmersión, GFP

10 Fluorescencia (definiciones) Tipos de fluorescencia: La fluorescencia secundaria ocurre cuando una molécula específica o un grupo capaz de fluorescer, un fluorocromo, se introduce en la estructura de la muestra. Éste es el procedimiento para la mayoría de las aplicaciones biológicas de la microscopía de fluorescencia.

11 Fluorescencia Espectros de excitación y emisión: Debido a la diferente configuración electrónica de los fluorocromos cada uno presenta un espectro de excitación y de emisión característico y único. Los fabricantes dan el pico de máxima excitación y el pico de máxima emisión o bien los espectros de excitación y emisión.

12 Fluorescencia Espectros de excitación y emisión: Fluoresceína (FITC) pH = 9 pH = 13

13 ¿Porqué usar Fluorescencia? Para facilitar pequeñas estructuras debido al alto contraste de la imagen sobre el fondo (buena relación señal a ruido) Fondo Negro (pupilas se abren apliamente) Fluorescencia

14 Ciencias de la Vida 1.Inmunohistoquímica/Histología Para identificar la distribución de una proteína específica dentro de un tejido, un fluorocromo puede ser usado para marcar la proteína vía un anticuerpo 2. Biología Para monitorear rápidamente concentraciones fisiológicas cambiantes de iones, e.g. calcio, magnesio y valores pH en células vivas. Para estudiar viabilidad de tejidos animales/humanos y patógenos. Microscopía de Fluorescencia - Aplicaciones

15 EGFP expression in muscles of C. elegans Filtersystem: EGFP longpass GFPs como proteína que se expresa en cuerpos vivos (GFP: Proteína fluorescente verde, de medusa Aequorea) Microscopía de Fluorescencia - Aplicaciones

16 DapiFITCCy 3 Cy 7Cy 5Cy 3.5 Cromosomas con 6 fluorocromos Microscopía de Fluorescencia - Aplicaciones

17 FISH (Fluorescence in situ Hybridisation) Microscopía de Fluorescencia - Aplicaciones

18 II. Ciencia de Materiales Inspección de Circuitos electrónicosInspección de Circuitos electrónicos Investigación de contaminantes en wafers semiconductoresInvestigación de contaminantes en wafers semiconductores Estudios de sedimentación petrológica en rocasEstudios de sedimentación petrológica en rocas Microscopía de Fluorescencia - Aplicaciones

19 Huecos en concreto Microscopía de Fluorescencia - Aplicaciones

20 Que equipo se requiere? Microscopio con accesorio de fluorescencia Fuente de luz: HBO 50/100 Watt o LED Set de Filtros (3 filtros en 1 cubo) Objetivos con alta apertura numérica (A.N.) Equipo Necesario

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22 Fuente de poder Accesorio de fluorescencia Caja de lámpara Cubos con filtros Equipo Necesario

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25 Lámpara de mercurio HBO100Watt Arco de dimensión pequeña Gran cantidad de energía Relación Excitación/Emisión 10000:1 Conclusión: Utiliza cada fotón disponible Equipo Necesario La lámpara de mercurio

26 Lámpara LED específica para cada longitud de onda, larga vida, no requiere reemplazo de lámpara, no caliente, no se requiere centrado, permite controlar intensidad Lámpara Aluro Metálico genérica para todas las longitudes de onda, larga vida, no requiere reemplazo de lámpara, no caliente, no se requiere centrado, permite controlar intensidad Equipo Necesario Las lámparas LED o de Aluro Metálico

27 Filtro de Excitación Espejo dicróico Filtro de Barrera o Emisión (longpass, bandpass) Equipo Necesario El cubo con filtros

28 Filtros Estándard de Fluorescencia DAPI & Hoechst: Exciter D350/50 Dichroic 400LP Emitter D460/50 FITC: Exciter D480/30 Dichroic 505LP Emitter D535/40 TRITC/Cy3: Exciter D540/25X Dichroic 565DCLP Emitter D605/55m

29 Especificacón del Filtro - FITC Perfiles de Absorción y Emisión

30 DAPI Selectividad de Filtros

31 FITC Selectividad de Filtros

32 TRITC Selectividad de Filtros

33 Sobreposición de imágenes Selectividad de Filtros

34 DAPI Selectividad de Filtros

35 FITC Selectividad de Filtros

36 TRITC Selectividad de Filtros

37 Sobre- posicio- namiento Multi- Focus Multi- Focus! Selectividad de Filtros

38 Sistemas de Filtros de banda Dual/Triple CFP / YFP / DsRed Hela cell, tripleband CFP / YFP / DsRed Hela cell, singleband overlay (mFIP, SIS) + Visión completa + no requiere cambio de filtro (tiempo real) + desplazamiento de píxel cero ± colores mezclados - Pérdida de intensidad comparada con filtros de una sola banda

39 No existe conexión directa entre lentes de fluorita y fluorescencia Fluorita viene de CaF 2, un mineral usado antiguamente para fabricar objetivos de gran apertura numérica La Apertura Numérica es más importante que la corrección de curvatura Se pueden usar objetivos de contraste de fases pero no es recomendable porque reducen entre un % de intensidad Equipo Necesario Lentes Objetivos Plan Apo 20x/0.60 Plan Fluar 20x/0.50 Plan 20x/0. 40

40 FIN Gracias por prestar atención!!!


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