SECUENCIACION DEL DNA SECUENCIACION DEL DNA. La propiedad mas importante del DNA es su secuencia de nucleótidos. La secuenciación es la determinación.

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1 SECUENCIACION DEL DNA SECUENCIACION DEL DNA

2 La propiedad mas importante del DNA es su secuencia de nucleótidos. La secuenciación es la determinación del orden de los nucleótidos.

3 Secuenciación por el método de Maxam-Gilbert Esta basada en la modificación química del dna y posterior escisión de bases específicas. Ventaja: El dna que se usa directamente (no requieres ser clonado) Desventajas: ha quedado en desuso por su complejidad. Los reactivos de este método no se pueden adaptar para usarse en un kit biológico

4 El método requiere el marcaje radiactivo en el extremo 5´ y la purificación del fragmento que se requiere secuenciar. De esta manera las longitudes de los fragmentos corresponden a posiciones en la secuencia donde esta esa base

5 Ejemplo:

6 Métodos de terminación de la cadena (sanger) Es el método más usado para la secuenciación es el conocido como técnica de terminación de cadena de Sanger, la cual se ha perfeccionado conociéndose actualmente como la técnica del didesoxi. Se denomina así por ser necesario los didesoxirribonucleótidos (figura 1), que han perdido su grupo alcohol OH del carbono 3'. En la figura 2 vemos un nucleótido normal con el grupo alcohol en el carbono 3'.

7 Como "molde" se utiliza una de las cadenas del fragmento de ADN que se va a secuenciar Como "cebador" para iniciar la síntesis, se necesita un corto oligonucleótido complementario del extremo de la cadena desoxinucleótidos de las cuatro bases: dAMP, dTMP, dGMP, dCMP. didesoxinucleótidos de una base en cada una de las cuatro reacciones de secuenciación.

8 Al añadir la ADN-polimerasa, comienza la polimerización en el cebador, pero cesa el incorporarse un didesoxinucleótido porque la ausencia de un hidroxilo 3’ impide el agregado del próximo nucleotido.

9 Deben prepararse cuatro reacciones de secueciación, cada una con un didesoxi distinto. Los fragmentos resultantes se separan por tamaño mediante electroforesis, se autorradiografían, y la sucesión de bandas de cada una de las cuatro reacciones, comparándolas entre sí,dan la secuencia del ADN

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11 Secuenciación por terminador fluorescente La secuenciación se puede llevar a cabo en una sola reacción. Se marcan los cuatro didesoxinucleótidos con colorantes fluorescente. Éstos terminan la cadena dando fluorescencias a diferentes longitudes de onda. Los fragmentos de ADN de menor tamaño que ya han sido detectados se dejan escapar del gel permitiendo aumentar el número de nucleótidos que se pueden determinar.

12 Automatización y preparación de las muestras Más de 384 muestras marcadas por fluoresciencia de una sola vez y 24 ciclos de secuenciación al día. Preparar por separado las reacciones de secuenciación mediante una termocicladora, lavado y resuspensión en una solución buffer antes de pasar las muestras al secuenciador. Limitaciones: alturas y formas de picos desiguales en los registros del cromatograma producto de los terminadores fluorescentes. Solución: introducción de nuevos sistemas enzimáticos de polimerasas de ADN y colorantes que minimizan la variabilidad de la incorporación..

13 Estrategias de secuenciación a gran escala Los procedimientos actuales pueden secuenciar fragmentos relativamente cortos (de entre 300-1000 nucleótidos de longitud) en una sola reacción. Se presenta la capacidad insuficiente de separación para resolver grandes fragmentos de ADN cuyo tamaño difiera en un sólo nucleótido. Secuenciación por fuerza bruta: ensamblar electrónicamente fragmentos cortos de ADN con secuencias solapadas.

14 NUEVOS METODOS DE SECUENCIACION Secuenciación de alto rendimiento  Bajo costo  Mayor rendimiento

15 1º) Amplificación clonal in Vitro 2º)Secuenciación paralelizada PCR de emulsión PCR de puente muchas copias de un solo fragmento Moléculas amplificadas se secuencian Secuenciación por ligamiento PirosecuenciacionSecuenciacion por sintesis

16  Secuenciación por hibridación  Espectrometría de masas Otras tecnologías de secuenciación:

17 FIN Gracias por su atención